生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程制造技术

本发明专利技术的一些方面涉及用于使用经改造微生物将碳源转化为生物燃料或生物燃料前体的方法。本发明专利技术的一些方面涉及发现微生物中脂质代谢的关键调节因子。本发明专利技术的一些方面涉及用于生产生物燃料或生物燃料前体的经改造微生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程相关申请根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2010年3月2日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/309,782的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术至少部分地涉及采用经改造的细胞或微生物将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物，如三酰甘油)的领域。联邦政府资助研究导致本文所公开专利技术的某些方面的研究(至少部分)由能源部资助69106899支持。美国政府享有本专利技术的某些权利。
技术介绍
可持续生产的生物燃料是化石燃料的替代品，并且可以有助于缓解对易于得到的化石燃料储备的消耗，同时避免与化石燃料相关的污染和温室气体排放，从而以可持续的方式满足对负担得起的能源的日益增长的需求。然而，现有生产方法的若干缺点妨碍了广泛实施生物燃料生产，例如生产生物燃料的植物与粮食作物竞争有农业价值的土地面积，或者使用仅有限供应的工业物质作为碳源。
技术实现思路
对化石燃料之可持续性和可再生性的日益增加的关注使得开发了不同来源的多种替代性生物燃料，包括由微生物(如细菌或酵母)从可再生资源合成的脂质。可用作生物燃料或生物燃料前体的脂质包括例如脂肪酸及其衍生物(例如，三酰甘油)。微生物合成的生物燃料或生物燃料前体的经济可行性依赖于使用具有包括多个有利特性之组合的表型的适合微生物，所述有利特性例如允许将碳有效转化为生物燃料或生物燃料前体的代谢、高的生物质形成率、生物燃料或生物燃料前体的高产率、生物燃料或生物燃料前体的高水平细胞内积累或分泌、对原料(碳源和相关物质)和所合成产物(例如，脂肪酸或三酰甘油)的良好耐受以及生物燃料或生物燃料前体的稳定性(例如在低碳源浓度下)。转化产率(每克底物(例如葡萄糖)所产生的油的克数)尤为重要。通常用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物不符合足够允许以工业规模经济地生产生物燃料的所需表型。本专利技术的一些方面涉及在微生物中改造所需特性以生产生物燃料或生物燃料前体。虽然自二十世纪三十年代和二十世纪四十年代起，已研究了微生物中的脂质和脂肪酸代谢(参见，例如Woodbine，M.1959，Microbialfat：Microorganismsaspotentialfatproducers.Prog.Ind.Microbiol.1：181)，但是，尽管在遗传改造微生物或优化生产过程的条件方面作出了诸多努力，在微生物中改造与生物燃料生产相关的期望表型方面的进展仍然很小。到目前为止，遗传改造工作主要集中在操作脂肪酸合成通路上游或其中的基因靶标和优化发酵或培养条件(例如，通过用脂肪酸补充生长培养基)。遗传改造微生物的一个主要障碍是缺少靶微生物中(例如产油(oleaginous)酵母中)关键代谢通路调节因子的基因组信息和注释。因此，在用于生产生物燃料的微生物中仍然缺少控制将碳水化合物向脂质转化的关键调节因子的功能鉴定和注释。本专利技术的一些方面涉及将产油酵母解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)鉴定为用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。本专利技术的一些方面涉及发现微生物中脂肪酸代谢的关键调节因子。本专利技术的一些方面涉及发现硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)作为微生物中碳水化合物向脂质转化的关键调节因子。本专利技术的一些方面涉及编码微生物中脂肪酸代谢的关键调节因子的分离的核酸。本专利技术的一些方面提供了编码产油微生物的脂肪酸代谢之关键调节因子(例如，SCD基因产物)的分离的核酸。本专利技术的一些方面涉及操作脂肪酸代谢调节因子的活性(例如，通过遗传操作)来改造用于生产生物燃料的微生物。本专利技术的一些方面涉及改造用于生产生物燃料或生物燃料前体的分离的微生物。本专利技术的一些方面涉及针对将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体进行优化的分离的微生物，例如，包含活性增加的SCD基因产物的产油微生物。本专利技术的一些方面涉及改造用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物培养物。本专利技术的一些方面涉及使用改造用于生产生物燃料的微生物将碳水化合物源转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法。本专利技术的一些方面涉及使用改造用于生产生物燃料的微生物将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的生物反应器。本专利技术的一些方面提供了使用经改造微生物至少部分地将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体的方法。本专利技术的一些方面涉及分离的产油细胞，其包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶(malicenzyme)、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低选自JNK2和Δ-12去饱和酶的基因的表达的遗传修饰。在一些实施方案中，分离的产油细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：(a)包含在合适的同源或异源启动子的控制下编码基因产物的核酸的表达盒；(b)包含在异源启动子的控制下编码靶向基因产物的干扰RNA的核酸的表达盒；和/或(c)插入细胞基因组的核酸构建体，所述构建体包含提高或降低基因产物表达的核酸序列。在一些实施方案中，异源启动子是诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，核酸构建体抑制或破坏(disrupt)编码基因产物的天然基因的天然调节，导致天然基因的过表达。在一些实施方案中，核酸构建体抑制或消除天然基因的表达。在一些实施方案中，由缺失、破坏、突变和/或替换调节基因表达的调节区或调节区的一部分来介导天然基因的天然调节的抑制或破坏，或者由缺失、破坏、突变和/或替换天然基因的编码序列或调节天然基因表达的调节区或调节区的一部分来介导天然基因表达的抑制或消除。在一些实施方案中，由组成型或诱导型表达靶向JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因产物且抑制所述基因表达的核酸来介导JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因表达的降低。在一些实施方案中，靶向JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因转录本的核酸通过RNAi途径抑制转录本的表达。在一些实施方案中，靶向JNK2和/或Δ-12去饱和酶转录本的核酸是siRNA、shRNA或microRNA。在一些实施方案中，通过在微生物中敲除野生型基因(例如，通过核酸构建体(如靶向性载体)与基因组JNK2或Δ-12去饱和酶基因座的同源重组)从而破坏野生型基因的表达来降低JNK2和/或Δ-12去饱和酶的表达。在一些实施方案中，将核酸构建体插入细胞的基因组中。在一些实施方案中，基因产物表达的提高的或降低赋予细胞将碳水化合物源转化为脂肪酸、脂肪酸衍生和/或TAG的有利表型。在一些实施方案中，有利表型是改变的脂肪酸谱、改变的三酰甘油谱、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的转化产率、细胞中增加的三酰甘油积累和增强的对渗透压的耐受、增加的增殖速率、增加的细胞体积和/或细胞对浓度为致死和/或抑制其相同类型细胞的未经修饰细胞之增殖的物质增强的耐受。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2.5倍。在一些实施方案中，与相同细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.02 US 61/309,7821.分离的产油真菌细胞，其包含提高SCD表达的重组硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因和/或提高SCD表达的，相对于相同类型未修饰细胞的，至少一个额外的SCD基因拷贝，和降低Δ-12去饱和酶表达的遗传修饰。2.权利要求1所述的分离的产油真菌细胞，其中降低Δ-12去饱和酶基因产物表达的遗传修饰为用核酸构建体转化，所述核酸构建体包含：(a)包含合适的同源或异源启动子的表达盒，(b)包含编码靶向Δ-12去饱和酶基因产物之干扰RNA的核酸的表达盒，和/或(c)在插入所述细胞的基因组时降低Δ-12去饱和酶基因产物的表达水平的核酸序列。3.权利要求1所述的分离的产油真菌细胞，其中：所述细胞包含重组硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因；所述重组SCD基因包含所述细胞基因组中的内源核苷酸序列；所述内源核苷酸序列编码所述细胞内源的SCD蛋白；所述重组SCD基因是重组的是因为所述内源核苷酸序列已通过诱变或者通过重组事件被改变；并且所述诱变或重组事件提高了天然SCD蛋白的表达。4.权利要求2所述的分离的产油真菌细胞，其中所述核酸构建体抑制或消除所述Δ-12去饱和酶基因产物的表达。5.权利要求4所述的分离的产油真菌细胞，其中通过缺失、破坏、突变和/或替换天然Δ-12去饱和酶基因的编码序列或调节天然Δ-12去饱和酶基因表达的调节区或调节区的一部分来介导对Δ-12去饱和酶基因产物表达的抑制或消除。6.权利要求2、4或5所述的分离的产油真菌细胞，其中所述核酸构建体插入所述细胞的基因组中。7.权利要求1至6中任一项所述的分离的产油真菌细胞，其中SCD表达的提高赋予所述细胞将碳水化合物源转化为脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油(TAG)的有利表型。8.权利要求1至7中任一项所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞是产油酵母细胞。9.权利要求8所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)细胞。10.培养物，其包含权利要求1至9中任一项所述的产油真菌细胞。11.权利要求10的培养物，其还包含碳水化合物源。12.权利要求11所述的培养物，其中所述碳水化合物源是可发酵糖。13.权利要求11或12所述的培养物，其中所述碳水化合物源是单糖。14.权利要求11或12所述的培养物，其中所述碳水化合物源是葡萄糖和/或甘油。15.权利要求11至14中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源未灭菌。16.权利要求11至15中任一项所述的培养物，其中所述培养物保持在未灭菌条件下。17.权利要求11至16中任一项所述的培养物，其中所述培养物不包含对所述产油真菌细胞有选择性的抗生素或抗增殖剂。18.权利要求11至17中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源来自植物或藻类生物质。19.权利要求11至18中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源来自纤维素、半纤维素、淀粉或甘油。20.权利要求18或19所述的培养物，其还包含纤维素水解酶或半纤维素水解酶。21.权利要求18至20中任一项所述的培养物，其中所述生物质或所述纤维素或半纤维素在热水或稀酸或氨纤维膨胀处理中预处理，用水解酶预处理，通过蒸汽预处理和/或石灰预处理。22.一种用于生产脂肪酸或三酰甘油的方法，其包括使碳水化合物源与权利要求1-9中任一项的分离的产油真菌细胞接触；和在适于由所述细胞至少部分地将所述碳水...

【专利技术属性】
技术研发人员：格里戈里·斯特凡诺普洛斯，赛义德·侯赛因·伊马姆·阿比迪，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：
国别省市：