干扰素α5的制备方法技术

一种在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中通过表达产生干扰素α5（IFNa5）蛋白质的方法，该方法使得多肽链的N-末端的额外甲硫氨酸残基的掺入以及氧化类型的产生最小化。IFNa5蛋白质可以使用有效的方法来纯化从而产生有生物活性的IFNa5。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在生产IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中通过表达来生产干扰素α 5(IFNa5)蛋白质的方法，其中该多肽链的N-末端的额外的甲硫氨酸残基的掺入以及其氧化类型的产生均为最小化的。IFNa5蛋白质可以使用有效的方法来纯化从而产生生物学上有活性的IFNa5。
技术介绍
干扰素(IFN)是ー组天然产生的多效糖蛋白，被称为细胞因子，不同种类的细胞(上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)在受到一系列的刺激(病毒、细菌、细胞、肿瘤和大分子)诱导之后会分泌产生，并且具有抗病毒、抗增殖和免疫调节特性以及镇痛作用。在内源产生或给药之后，干扰素与细胞表面的特异性受体相互作用，并开始信号从细胞质到达细胞核的转导，诱导编码具有抗病毒和免疫刺激活性的特定蛋白质的基因的表达。人们已经认识到了 IFN的医用潜力，如许可在人体上施用的ー些不同种类的IFN，例如作为药物来治疗多发性硬化的IFNla (Rebif，Avonex)、IFNlb (Betaseron)，以及作为药物来治疗恶性病(癌症)和病毒病的重组人IFNa2a (Roferon A)和IFNa2b (Intron A)。基于IFN通过其来传递信号的受体的种类，人IFN分为三个主要的类型，S卩，(i)IFN I型，(ii)IFN II 型,以及IFN III型。被称为I型IFN的IFNa和β在结构上相关，在酸性pH中稳定，并且竞争相同的细胞受体(IFNAR)。目前，IFNa、β和Y可以通过重组的形式来制备，这具有双重优势，可以获得比通过从天然来源(白细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)分离的高出很多数量的产物，并且降低了纯化和检测产物安全性的方法的复杂程度。事实上，大部分市售药用级重组体IFN是由大肠杆菌产生并纯化获得的。大肠杆菌重组蛋白质表达系统已经是，并且仍然是，生产IFN所选择的系统。实际上，IFN基因没有内含子，并且蛋白质产物一般是非糖基化的。而且，大肠杆菌可以迅速地生长到高细胞密度，并且被用来生产重组蛋白质的菌株已经进行了遗传修饰，从而一般认为其对于大規模的发酵是安全的。IFN cDNA的表达是在其最初被克隆之后不久在大肠杆菌中直接完成的。事实上，IFNa (IFNa)是最先通过大肠杆菌用DNA重组技术的方法产生的蛋白质之ー 。然而，IFN在大肠杆菌中的表达显示出了ー些问题。在大肠杆菌中大量表达的IFN经常沉淀形成不溶的被称为包涵体(IB)的聚集体简言之，一般情况下，形成错误折叠的蛋白质，因此在生物学上不具有活性 0为了得到天然形式的蛋白质，需要将所述的IB进行变性处理，随后进行复性、氧化，如果那样的话，需要形成如在天然蛋白中的ニ硫键。而且，靶蛋白序列(例如，IFN) N-末端的另外的甲硫氨酸残基的掺入是在大肠杆菌中表达蛋白质的ー个特征。众所周知，分布在蛋白质序列中的甲硫氨酸残基易于氧化。这些步骤可能发生在生产蛋白质或包含所述蛋白质的药物组合物(如果其能被用作药物，例如IFN)的过程中，并且更多发生在高温下长期保存的时期内。虽然已经开发了多种在细菌中生产和纯化IB形式的IFN的方法，但是还存在阻碍成功生产和IFN，即治疗水平的IFN的其他因素，例如必须清除在目标IFN的N-末端掺入的额外甲硫氨酸残基以及产生的其氧化类型(如果该产物用作药)，因此降低了 IFN生产的总得率，増加了纯化过程的复杂性，并且使得生产和纯化治疗水平的a IFN的方法很费力。因此，仍需要能够在大肠杆菌宿主细胞中以高得率和经济有效的方式来生产治疗水平的IFNa，特别是IFNa5的方法。专利技术概述专利技术人出人意外地发现，发酵培养基中的微量元素(痕量元素)的浓度在IFNa5的翻译后修饰中起了重要的作用。因此，控制发酵培养基中的微量元素的浓度，可能使产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中IFNa5的N-末端的额外的甲硫氨酸残基的掺入最小化，并且使其氧化类型的产生最小化，提高产品得率并简化纯化过程，因此使得在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中以经济有效复杂度低的方法来生产和纯化IFNa5，即治疗水平的IFNa5。实施例4示出了氧化甲硫氨酸化的人IFNa -5(hIFNa5)形式的形成被有效清除，并且こ酰化的hIFNa5形式的量降低了两倍(即成为原来的一半)，其中I升(L)的碳料液包含大约3. OmL至大约3. 7mL的微量元素原液，并且，优选地，在诱导之后的平均特定培养物生长率(μ)等于或大于O. 17。因此，一方面，本专利技术涉及在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中表达干扰素α 5 (IFNa5)蛋白质的方法，其包括a)提供一种产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞；b)在通过所述产生IFNa5的重组大肠杆菌宿主细胞中有效表达所述IFNa5蛋白的条件下，在发酵培养基中培养该产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞，所述发酵培养基添加碳料液，其中-所述发酵培养基不含动物来源或酵母来源的组分，并且-所述碳料液包括碳源以及每升添加的碳料液中大约3.O至大约3. 7mL的微量元素溶液；并且c)分离和任选地纯化表达的IFNa5蛋白质。在ー个特定的具体实施方式中，所述大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株，如大肠杆菌Ion_/ompT_蛋白酶缺陷型宿主菌株,优选为大肠杆菌BL21菌株,最优选大肠杆菌BL21(DE3)菌株。在另ー个特定的具体实施方式中，当大肠杆菌菌株是大肠杆菌BL21(DE3)菌株时，步骤b)的条件包括用IPTG诱导。在另ー个特定的具体实施方式中，步骤c)分离和纯化表达的IFNa5蛋白质包括依次地，在裂解大肠杆菌宿主细胞之后，通过将所述IB进行增溶来分离所述的包涵体形式的IFNa5蛋白质(IB)，并将获得的混合物进行氧化复性，以及进行连续的一系列色谱法，以获得纯化的IFNa5，所述色谱法包括I)将包括复性的IFNa5的混合物进行疏水作用层析；2)将步骤I)获得的溶液进行阴离子交换色谱； 3)将步骤2)获得的溶液进行第一阳离子交换色谱；并且4)将步骤3)获得的溶液进行第二阳离子交换色谱，任选地，其中所述溶液用包括甲硫氨酸的缓冲液进行稀释，在ー个特定的具体实施方式中，所述IFNa5是，优选是，人IFNa5 (hIFNa5)。附图说明图I示出了构建IFNa5产生菌株的流程图。图2示出了初始质粒DNA pET28_IFN α -5的限制性内切酶酶切分析結果。泳道1-3和5-7 pET28-IFN α -5的限制性内切酶酶切分析；泳道I和5 pET28-IFN α -5/BamHI ;泳道 2 和 6 pET28-IFN a -5/NdeI ;泳道 3 和 7 :pET28_IFN a -5/NdeI+BamHI ；泳道 4 和 8 pET28-IFN α-5，未切害I]。DNA 分子标记(Gene Ruler DNA LadderMix, Fermentas, Lithuania)条带的大小以千碱基对(kbp)来表示。图3示出了中间物质粒IFN α-5的限制性内切酶酶切分析结果。该质粒源于单克隆。DNA 分子标记(Gene Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Lithuania)条带的大小以kbp表示。预期的片段大小(以bp计)在括号内给出。泳道I :pUC57-IFN α-5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴尔达斯·阿尔吉尔达斯·布梅里斯，
申请(专利权)人：迪格纳生物技术公司，
类型：
国别省市：