一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法技术

本发明专利技术涉及一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法，提出了一种改良型的DO-Stat甘油流加策略，本发明专利技术的方法大大提高猪α干扰素的诱导表达效率、确保了发酵的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法
本专利技术属于生物工程
；更具体地，本专利技术涉及一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法。
技术介绍
猪α干扰素(porcineinterferon-α，pIFN-α)是一种具有广阔应用前景的兽药[ChinsangaramJ等，JVirol,2001,75(12):5498-5503]。利用重组毕赤酵母进行发酵是生产猪α干扰素的主要手段，猪α干扰素可全部分泌于发酵液中。在完成重组菌的构建以及摇瓶工艺优化的基础上，研究重点已转移到发酵罐规模发酵工艺的优化上。近年来，有关猪α干扰素诱导工艺的优化研究显示，猪α干扰素的高效诱导表达与能否获取极高密度的重组毕赤酵母细胞直接相关。但是，即便在培养阶段获得浓度相同的高密度细胞、诱导阶段的操作条件也完全相同，不同发酵批次下的猪α干扰素的诱导表达水平有时却存在很大差异、导致其发酵生产性能的不稳定[YuRS等，BioprocBiosystEng，2010,33:473-483]。在利用重组酿酒酵母和大肠杆菌生产目标外源蛋白时，细胞高密度流加培养阶段的末期，代谢副产物乙醇和乙酸大量积累、严重抑制目标蛋白的表达是众所周知的事实[LinKH等，ApplMicrobiolBiotechnol,1989,32:313-316；LinKH等，JChemJpn,1991,17:680-685；JohnsonW等，BioprocBiosystEng,2002,25(2):111-120；AkessonA等，BiotechnolBioeng,2001,73(3):223-230]。在猪α干扰素发酵生产的流加培养期，一般使用DO-Stat法自动流加甘油、实现细胞的高密度培养。但是到了培养末期，细胞量达到极高密度(120～150g-DCW/L)后，由于耗氧量激增，使用DO-Stat法流加甘油会使培养液中的溶解氧浓度(DO)的基线水平(DO控制下限)瞬间或在相当长的时间(10～20min)内处于接近于0的水平。这样，毕赤酵母培养不断地在好氧与厌氧状态间来回切换，极易引起厌氧代谢副产物的生成与积累，最终严重影响到猪α干扰素的正常诱导表达和发酵生产的稳定性。至今，有关毕赤酵母高密度培养期内代谢副产物的生成积累及其对诱导期内目标蛋白表达影响的相关研究鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种重组毕赤酵母发酵生产猪α干扰素的方法，所述的重组毕赤酵母含有猪α干扰素表达盒，所述方法包括：(1)将重组毕赤酵母在以甘油为碳源的初始培养基中培养，当溶解氧浓度快速上升时，启动甘油流加；维持培养过程中乙醇浓度低于2g/L；当酵母细胞达到高密度时，停止流加甘油，饥饿培养酵母细胞至碳源耗尽，启动甲醇诱导培养；(2)在发酵液中流加甲醇和山梨醇，使甲醇浓度控制在5±1g/L，诱导表达猪α干扰素。在一个优选例中，步骤(1)中，当初始培养基中甘油耗尽时，启动改良型DO-Stat控制程序流加甘油培养基，包括：预先设定乙醇浓度的控制水平≤2g/L，当乙醇浓度超过该设定值，适度减小甘油流加的延迟时间；而当乙醇浓度低于该设定值时，适度增大甘油流加的延迟时间，以保证细胞的高速生长。在另一优选例中，按照下列公式调节甘油流加延迟时间：其中，T(k)和T(k-1)分别表示当前和上一个控制周期的流加延迟时间(min)；C*EtOH和CEtOH(k)分别表示乙醇浓度的控制水平及其当前在线测量值；P为甘油流加延迟时间的调整参数；P=0.67min·L/g。在另一优选例中，所述的酵母细胞达到高密度是指酵母细胞密度达到120～150g-DCW/L。在另一优选例中，重组酵母细胞接种量20±5%(v/v)。在另一优选例中，起始培养时，通气速度4±1vvm，温度30±2℃；pH6.0±0.2。在另一优选例中，步骤(2)中，甲醇和山梨醇进行共混流加。在另一优选例中，甲醇和山梨醇在流加培养基中的体积比为(0.5-6):1。在另一优选例中，甲醇和山梨醇在流加培养基中的体积比为(1-4):1；更佳地为1:1。在另一优选例中，所述方法还包括：从发酵产物中分离纯化猪α干扰素。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、总蛋白浓度、乙醇积累以及不同甘油流加策略下溶氧变化。A：不同批次诱导期总蛋白浓度：△，批次1；○，批次2；□，批次3；▲，批次4；●，批次5。B：不同批次诱导前乙醇积累情况：△，批次1；○，批次2；□，批次3；▲，批次4；●，批次5。C：传统DO-stat策略下DO变化。D：改进型DO-stat策略下DO变化。图2、不同批次(Batch)猪α干扰素最大浓度SDS-PAGE检测结果。具体实施方式本专利技术人通过研究流加甘油时厌氧代谢副产物是否积累及如何积累，以及厌氧代谢副产物积累对猪α干扰素诱导表达的影响，找到了猪α干扰素无法正常表达或发酵性能不稳定的根本原因，在此基础上提出了一种改良型的DO-Stat甘油流加策略。本专利技术的方法大大提高猪α干扰素的诱导表达效率、确保了发酵的稳定性。本专利技术中，“发酵”即指培养所述携带猪α干扰素基因)的重组毕赤酵母，使其生产猪α干扰素。更特别的，“发酵”为一种较大规模的生产过程，如发酵规模为0.5-500升，如发酵规模可以是1升、2升、5升、10升、100升等。本专利技术中，所述的“改良型DO-Stat控制程序”是指本专利技术优化的“DO-Stat控制程序”。可用于生产猪α干扰素的重组毕赤酵母基因组中含有至少一个猪α干扰素基因拷贝。本领域人员了解如何在适当的表达载体中构建可表达猪α干扰素的基因表达盒。在本专利技术中，对用于表达猪α干扰素的表达载体没有限制，可以是任何适于转化进入毕赤酵母并且表达猪α干扰素的表达载体。所述的表达载体例如是pPICZa。可采用常规的技术，将猪α干扰素基因克隆入表达载体的多克隆位点中，构建含有猪α干扰素表达盒的重组表达载体；再通过常规方法，将重组表达载体转化宿主。在本专利技术的一种优选方式中，使用的毕赤酵母是PichiapastorisKM71H。本领域人员易于理解的是，采用其它一些重组表达载体构建的表达猪α干扰素的重组毕赤酵母也可被用于本专利技术。用于配制发酵培养基的原料(如碳源、氮源、无机盐、微量元素)及其使用量可根据本领域常规利用重组毕赤酵母生产猪α干扰素时所用的原料及使用量而定，只要所述的发酵培养基能够为重组毕赤酵母生长、代谢和生产提高足够的营养成分，且不带来不良影响(如阻遏作用)或副作用(或产生副产物)。本专利技术中，可以采用以商业化或已报导的平板培养基，种子培养基，罐发酵初始培养基，甘油流加培养基，甲醇诱导培养基，山梨醇共混流加培养基。各培养基成分可参见参考文献[汪汇慧，金虎，高敏杰等；生物工程学报，2012,28(2)：164-177]。现有技术中，重组毕赤酵母发酵生产猪α干扰素(pIFN-α)过程性能不稳定，高密度细胞培养阶段的性能指标直接影响到甲醇诱导期的猪α干扰素表达水平。测定分析甲醇代谢关键酶基因的转录水平发现，甘油流加培养末期乙醇的大量和长期积累(超过6g/L)不可逆转地抑制醇氧化酶(AOX)的启动，是导致猪α干扰素无法正常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组毕赤酵母发酵生产猪α干扰素的方法，所述的重组毕赤酵母含有猪α干扰素表达盒，其特征在于，所述方法包括：(1)将重组毕赤酵母在以甘油为碳源的初始培养基中培养，当溶解氧浓度快速上升时，启动甘油流加；维持培养过程中乙醇浓度低于2g/L；当酵母细胞达到高密度时，停止流加甘油，饥饿培养酵母细胞至碳源耗尽，启动甲醇诱导培养；(2)在发酵液中流加甲醇和山梨醇，使甲醇浓度控制在5±1g/L，诱导表达猪α干扰素。

【技术特征摘要】
1.一种重组毕赤酵母发酵生产猪α干扰素的方法，所述的重组毕赤酵母含有猪α干扰素表达盒，其特征在于，所述方法包括：(1)将重组毕赤酵母在以甘油为碳源的初始培养基中培养，当初始培养基中甘油耗尽时，启动改良型DO-Stat控制程序流加甘油培养基，包括：预先设定乙醇浓度的控制水平≤2g/L，当乙醇浓度超过该设定值，适度减小甘油流加的延迟时间；而当乙醇浓度低于该设定值时，适度增大甘油流加的延迟时间，以保证细胞的高速生长；按照下列公式调节甘油流加延迟时间：其中，T(k)和T(k-1)分别表示当前和上一个控制周期的流加延迟时间(min)；C*EtOH和CEtOH(k)分别表示乙醇浓度的控制水平及其当前在线测量值；P为甘油流加延迟时间的调整参数；P＝0.67min·L/g；当酵母细胞达到高密度时，停止流加甘油，饥饿培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：于瑞嵩，史仲平，李震，高敏杰，丁健，董世娟，朱于敏，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，江南大学，
类型：发明
国别省市：上海;31