一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体，通过克隆技术将pDonor‑IRF3全长的穿梭质粒同源重组克隆到慢病毒BiLC表达载体中；所述慢病毒BiLC表达载体由高斯荧光素酶从109位氨基酸的位置分为N端和C端，记为GlucN和GlucC，形成慢病毒表达载体IRF3‑BiLC。本发明专利技术的有益效果：第一：与目前是用的I型干扰素应答报告系统相比，IRF3‑BiLC的报告系统具有特异的反应I型干扰素的应答。第二：IRF3‑BiLC的报告系统能够直接且快速的反应瞬时的或者是持续性的I型干扰素的应答。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体及其制备方法与应用，属于医药

技术介绍
人体在遭受病毒如流感病毒、丙肝病毒和疱疹病毒等以及细菌感染会引起天然免疫(innate immunity)和获得性免疫反应(adaptiveimmunity)(1)。其中，天然免疫反应主要是通过诱导干扰素(Interferon,IFN)的产生，激活下游的干扰素诱导基因(ISGs)，从而发挥抗病毒作用(2,3)。对于RNA病毒，如流感病毒和丙肝病毒，病毒侵染进入细胞，释放出来的RNA能被细胞内的RNA识别受体如RIG-I、MDA5等，然后招募线粒体上的IPS-1蛋白以及磷酸化TBK1蛋白，被磷酸化的TBK1蛋白能够引起IRF3蛋白的磷酸化和二聚体的形成，从而进入细胞核引起干扰素的产生(4)。对于DNA病毒，如疱疹病毒和腺病毒，其进入体内后释放出来的DNA能被DDX41、cGAS以及IFI16等DNA识别受体识别，并诱导STING的多聚，从而引起TBK1的磷酸化以及IRF3二聚的活化，进而使干扰素转录翻译(5-7)。对于细菌侵染，主要是通过细胞膜上的TLR4识别受体识别细菌的LPS物质，从而引起下游TRIF、TRAF6、TBK1以及IRF3的二聚体的激活，从而使干扰素应答反应。产生的干扰素能够通过诱导ISGs的表达，从而使细胞能够清除侵染进入的RNA病毒或者DNA病毒。因此，干扰素应答在病毒和细菌侵染过程中异常重要。为了更好和有效地抵抗病毒以及细菌的侵染以及清除，对干扰素应答的调节机制的研究尤为重要。目前，干扰素激活反应元件的荧光素酶报告(ISRE-Luc)做为研
究干扰素产生机制研究的主要报告系统。ISRE-Luc是一个模拟细胞基因组的反应过程，其拥有一个与基因组一样序列的ISRE启动子，启动子后接有一个全长的人源化的萤火虫荧光素酶的表达基因。当细胞遭受病毒或者细菌感染时，其能引起细胞内的干扰素应答反应，从而是ISRE启动子转录活化，从而引起荧光素酶基因的转录翻译和表达。因此，通过检测萤火虫荧光素酶的活性，可以反应细胞内干扰素应答反应的强度。目前，其主要用于一些蛋白分子或者是药物对干扰素应答调节机制的研究和筛选。然后，ISRE的转录激活能被IRF3二聚体、IRF7二聚体识别并发生转录(8)；同时转录翻译产生的干扰素能够二次激活放大通过干扰素识别受体(IFNAR1等),引起STAT1/STAT2/IRF3(ISGF3)三聚体的形成，并能识别ISRE并引起转录(9,10)。因此，ISRE-Luc不能特异及精确地反应细胞内干扰素调节机制；其次，由ISRE的二次放大需要依赖细胞的干扰素识别受体(IFNAR1等)，因此，其不适合用于敲除IFNAR1或者是STAT1等活性收到影响等体系的条件下检测细胞的干扰素调节机制；第三，ISRE-Luc需要转录和翻译水平，其不能很好地反应对于一些分子或者药物在转录水平或者是翻译水平对干扰素应答的调节。综上所述，一个特异、灵敏、直接且被能广泛应用的干扰素应答反应的报告系统具有广阔的应用前景。以上
技术介绍
中提及的文献具体分别参考于以下：1.Wu,J.,and Z.J.Chen.2014.Innate immune sensing andsignaling of cytosolic nucleic acids.Annual review of immunology32:461-488.2.Yan,N.,and Z.J.Chen.2012.Intrinsic antiviral immunity.Nat Immunol 13:214-222.3.Kumar,H.,T.Kawai,and S.Akira.2011.Pathogenrecognition by the innate immune system.International reviews ofimmunology 30:16-34.4.Tamura,T.,H.Yanai,D.Savitsky,and T.Taniguchi.2008.TheIRF family transcription factors in immunity and oncogenesis.Annual review of immunology 26:535-584.5.Zhang,Z.Q.,B.Yuan,M.S.Bao,N.Lu,T.Kim,and Y.J.Liu.2012.The helicase DDX41senses intracellular DNA mediated bythe adaptor STING in dendritic cells(vol 12,pg 959,2011).NatImmunol 13:196-196.6.Wu,J.X.,L.J.Sun,X.Chen,F.H.Du,H.P.Shi,C.Chen,and Z.J.J.Chen.2013.Cyclic GMP-AMP Is an EndogenousSecond Messenger in Innate Immune Signaling by Cytosolic DNA.Science 339:826-830.7.Ishikawa,H.,and G.N.Barber.2009.Sting is an endoplasmicreticulum adaptor that facilitates innate immune signaling.Cytokine 48:128-128.8.Honda,K.,H.Yanai,H.Negishi,M.Asagiri,M.Sato,T.Mizutani，N.Shimada，Y.Ohba，A.Takaoka，N.Yoshida，and T.Taniguchi.2005.IRF-7 is the master regulator of type-Iinterferon-dependent immune responses.Nature 434:772-777.9.Liu,S.Y.,D.J.Sanchez,R.Aliyari,S.Lu,and G.Cheng.2012.Systematic identification of type I and type IIinterferon-induced antiviral factors.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 109:4239-4244.10.Fu,X.Y.,D.S.Kessler,S.A.Veals,D.E.Levy,and J.E.Darnell,Jr.1990.ISGF3,the transcriptional activator induced byinterferon alpha,consists of multiple interacting polypeptide chains.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of Ame本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体，其特征在于：通过克隆技术将pDonor‑IRF3全长的穿梭质粒同源重组克隆到慢病毒BiLC表达载体中；所述慢病毒BiLC表达载体由高斯荧光素酶从109位氨基酸的位置分为N端和C端，记为GlucN和GlucC，形成慢病毒表达载体IRF3‑BiLC。

【技术特征摘要】
1.一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体，其特征在于：通过克隆技术将pDonor-IRF3全长的穿梭质粒同源重组克隆到慢病毒BiLC表达载体中；所述慢病毒BiLC表达载体由高斯荧光素酶从109位氨基酸的位置分为N端和C端，记为GlucN和GlucC，形成慢病毒表达载体IRF3-BiLC。2.如权利要求1所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在于：所述慢病毒载体可以构建能直接反应I型干扰素应答的细胞系。3.如权利要求1所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在于：所述细胞系为THP-1(IRF3-BiLC)细胞系或THP-1-Dual细胞系。4.如权利要求2所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在于：所述细胞系构建方法包括如下步骤：S1、质粒的构建：构建pEntry-IRF3质粒；通过特异性引物将IRF3基因进行扩增，并对扩增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取pEntry-IRF3全长的穿梭质粒；S2、慢病毒表达载体构建：采用GlucN和GlucC部分，分别克隆到慢病毒载体上；S3、慢病毒载体构建：通过克隆技术，将构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦晓峰，王子宁，纪静芸，
申请(专利权)人：苏州奥特铭医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32