一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法，包括：(1)将重组鸡干扰素γ的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后的上清提取总蛋白；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化；(3)向重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组鸡干扰素γ标准品。按照此方法制备的重组鸡干扰素γ抗病毒活性标准品工作效价为：2.4×1010U/mL；SDS‑PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组干扰素标准品的制备方法，具体涉及一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法。
技术介绍
肉用家禽在养殖过程中常会感染致病菌，从而使养殖业蒙受巨大损失。当前所采用的措施是应用疫苗或抗生素使动物免受疾病的侵袭。但是，疫苗只能针对特定的病原产生保护，在动物没有明显症状时，应用广谱抗生素仅可在短期内使动物免受致病菌的侵袭。然而，由于过度使用广谱抗生素，尤其是与人应用相同的抗生素,极易引起细菌的耐药性，而且抗生素可残留在肉制品中，通过食物链直接影响人类的健康，该问题已引起广泛关注。世界卫生组织已开始建议停止在肉制品中使用与人用抗生素相同或有交叉反应的抗生素。同时，他们呼吁应用环境友好的方法来控制疾病。这些动物一旦感染发病，则有起病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，鸡与人类密切接触，某些动物病毒性传染病还给人类健康带来潜在威胁。目前对鸡病毒性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素。但由于养殖环境不完善，病毒变异以及机体抵抗力变化等原因，使传统的预防和治疗途径受到了巨大挑战，大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给人类健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒的不断出现给鸡养殖业带来的巨大危害。因此，积极治疗家禽、家畜病毒病将是人类最为关注的问题。IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三类。现已知，γ型IFN是在特定的抗原刺激作用下由T细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物学活性的糖蛋白，是发现最早、研究最多的细胞因子。随着研究的深入，但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。鸡IFN是一类能诱导鸡细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子。因此，IFN是当今应用前景广阔的重要生物制剂之一。目前，近年来,研究人员采用RT-PCR技术先后成功克隆了鸡干扰素基因,得到的鸡IFN—α、γ基因的开放阅读框架(ORF)分别由约579个和492个核苷酸组成。序列分析发现,不同品种鸡的同类IFN核苷酸同源性在90％以上。并先后在大肠杆菌、COS细胞、鸡痘病毒载体中成功表达。国内最早应用于兽医临床的是鸡白细胞IFN，但采用血细胞分离的方法获得的白细胞IFN成本较高，血源易被污染，很难进行工业化生产。而采用基因工程技术生产重组鸡γ型IFN除可避免上述弊端外，尚有纯度高，成本低，可规模化生产等优势，具有广阔的市场前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法，使得采用该方法制备的重组鸡干扰素γ可用于生物学活性检测，可用作重组鸡干扰素γ效价测定的参考标准。本专利技术所要解决的另外一个技术问题是提供一种重组鸡干扰素γ标准品。按照此方法制备的重组鸡干扰素γ抗病毒活性标准品工作效价为：2.4×1010U/mL；SDS-PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为35KD；N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为TCQTYNLFVLSVIMI。为了解决上述技术问题，本专利技术提供下列技术方案：一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：(1)将重组鸡干扰素γ的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后的上清提取总蛋白，所述重组鸡干扰素γ的重组菌为BL21/pET-32a-rChIFNγ工程菌，其DNA序列如Seq ID NO.1所示，原核表达载体pET-32α，以大肠埃希菌BL21作为原核表达的宿主；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化，即可得重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液；(3)向重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组鸡干扰素γ标准品。优选的，所述步骤(1)由以下步骤组成：(1-1)将工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养16-24小时，克隆接种至2-3ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养18h，得到菌液；(1-2)将步骤(1-1)得到的菌液接种至50-200ml LB培养基中，菌液与培养基的体积比为1∶10-100，置37℃摇床培养18h，转速为200-220r/min，作为发酵种子菌液；(1-3)将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；(1-4)将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10-100，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为220-270r/min、pH为7.2-7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到0.6-1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5-1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达4-5h，得到发酵液；(1-5)将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml生理盐水重悬菌体，在1000bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4℃条件下8000-12000r/min离心10-15min，收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组鸡干扰素γ蛋白。优选的，所述亲和层析方法如下：纯化所用洗脱液PH为8.0，由三羟甲基氨基甲烷、咪唑组成，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mM，咪唑的浓度为10mM，收集rChIFN-γ蛋白峰。优选的，所述阴离子交换层析纯化方法如下：将经过亲和层析纯化后收集的蛋白，进一步采用PH为6.5的洗脱液在阴离子交换层析柱上进行线性洗脱，洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、NaCl组成，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mM，NaCl的浓度为1M，收集rChIFN-γ蛋白峰。优选的，所述分子筛层析纯化方法如下：将离子交换层析收集到的样品浓缩后，进一步经分子筛层析柱纯化，采用pH为7.4的洗脱液洗脱，洗脱液由Na2HPO4和NaCl组成，Na2HPO4的浓度为50mM，NaCl的浓度为0.15M，收集rChIFN-γ蛋白峰。优选的，步骤(3)具体包括以下步骤：将重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/L磷酸缓冲液稀释后加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥。上述一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法制备得到的重组鸡干扰素γ标准品。优选的：重组鸡干扰素γ标准品的工作效价为2.4×1010U/mL。重组鸡干扰素γ标准品的效价测定方法，其特征在于：鸡胚成纤维细胞作为测试细胞，重组鸡干扰素γ标准品作为供试品，重组人干扰素γ作为对照品，将供试品和对照品分别制成不同的稀释度，在VSV/CEF系统上对重组鸡干扰素γ标准品效价进行标定。目前国际国内均没有重组鸡干扰素γ的标准品，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：(1)将重组鸡干扰素γ的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后的上清提取总蛋白，所述重组鸡干扰素γ的重组菌为BL21/pET‑32a‑rChIFNγ工程菌，其DNA序列如Seq ID NO.1所示，原核表达载体pET‑32α，以大肠埃希菌BL21作为原核表达的宿主；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化，即可得重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液；(3)向重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组鸡干扰素γ标准品。

【技术特征摘要】
1.一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：(1)将重组鸡干扰素γ的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后的上清提取总蛋白，所述重组鸡干扰素γ的重组菌为BL21/pET-32a-rChIFNγ工程菌，其DNA序列如Seq ID NO.1所示，原核表达载体pET-32α，以大肠埃希菌BL21作为原核表达的宿主；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化，即可得重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液；(3)向重组鸡干扰素γ纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组鸡干扰素γ标准品。2.根据权利要求1所述的一种重组鸡干扰素γ标准品的制备方法，其特征在于：步骤(1)由以下步骤组成：(1-1)将工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养16-24小时，克隆接种至2-3ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养18h，得到菌液；(1-2)将步骤(1-1)得到的菌液接种至50-200ml LB培养基中，菌液与培养基的体积比为1：10-100，置37℃摇床培养18h，转速为200-220r/min，作为发酵种子菌液；(1-3)将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；(1-4)将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10-100，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为220-270r/min、pH为7.2-7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到0.6-1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5-1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达4-5h，得到发酵液；(1-5)将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml生理盐水重悬菌体，在1000bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4℃条件下8000-12000r/min离心10-15min，收集上清；重复离心一次...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，王明丽，汪良青，赵雨，李树启，符修乐，戚仕梅，高耀辉，赖鹏飞，马腾飞，王利利，周炜，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34