本发明专利技术公开了一种如SEQ ID NO：1～3任意一项所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌、SEQ ID NO：1～3任意一项所示的核苷酸序列编码的干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白及其制备方法和用途。本发明专利技术干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)更容易特异结合在肿瘤组织上，不会很快随体液扩散，本发明专利技术干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白对肿瘤的治疗效果佳，临床应用前景良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因工程领域，具体设及一种干扰素A化与胶原结合结构域的融合蛋 白及其制备方法和用途。
技术介绍
干扰素（Interferon,IFN)是细胞因子的一类，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等 生物活性。干扰素有多个亚型，！型干扰素包括IFN-O(IFNA)、IFN-P，II型干扰素包括 IFN- 丫，III型干扰素包括IFN-A。在抗肿瘤治疗中，临床常用是IFNA2a和IFNA2b，它们 的一级结构仅差异1个氨基酸。在临床上，IFNA用于治疗诸如毛细胞白血病、黑色素瘤、滤 泡性淋己瘤、肾细胞瘤等肿瘤。IFNA发挥抗增殖活性包括直接作用和间接作用，直接作用通 过JAK-STAT信号转导通路导致细胞周期停滞、细胞坏死或细胞分化，间接作用则通过活化 免疫细胞，如淋己T细胞、自然杀伤细胞，抑制血管新生和诱导其他细胞因子表达。[000引 目前，IFNA化通常采用皮下、肌内、静脉给药，但蛋白注射后很快随体液扩散而使 得局部浓度很难达到治疗要求，如果大量注射则会对生物体产生负作用，而反复较低剂量 给药给患者带来不便和痛苦。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种干扰素A化与胶原结合结构域的融合蛋 白，其可W特异结合在肿瘤组织上。 阳0化]本专利技术提供了一种SEQIDNO:1~3任意一项所示的核巧酸序列。SEQIDNO:1所示的核巧酸序列含552个核巧酸，其中，第1-498位为IFNA的编 码序列，第499-531位为连接肤的编码序列；第532-552位为胶原结合结构域（CBD)的编码 序列。 阳007] SEQIDNO:2所示的核巧酸序列含558个核巧酸，除了包含SEQIDNO:1所示序 列W外，还包含连接肤的编码序列（第553-558位），该序列编码连接肤，用于连接C抓与组 氨酸标签。 SEQIDNO:3所示的核巧酸序列含579个核巧酸，除了包含SEQIDNO:2所示序 列W外，还包含编码组氨酸标签的核巧酸序列（第559-576位）W及终止密码子，添加编码 组氨酸标签的核巧酸序列是为了方便纯化。 本专利技术还提供了一种重组载体，它包含SEQIDNO:1~3任意一项所示的核巧酸 序列。优选地，所述的重组载体是重组祀T28a质粒。 本专利技术还提供了一种重组菌或转基因细胞系，它包含前述的重组载体。优选地，所 述的重组菌为重组大肠杆菌。 本专利技术干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白，它是由SEQIDNO:1~3任意 一项所示的核巧酸序列编码。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4~6任 意一项所示。SEQIDNO:4所示的的蛋白包括184个氨基酸，其由SEQIDNO:1编码，其中，第 1-166位为IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO:1中第1-498位核巧酸编码；第167-177位 连接肤的氨基酸序列，由SEQIDNO:1中第499-531位核巧酸编码；第178-184位为胶原结 合结构域（CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO:1中第532-552位核巧酸编码。 阳01引 SEQIDNO:5所示的的蛋白包括186个氨基酸，除了含有SEQIDNO:4所示的氨 基酸W外，还含有两个氨基酸组成的连接肤，其由SEQIDNO:2编码，其中，第1-166位为IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO:2中第1-498位核巧酸编码；第167-177位连接肤的氨 基酸序列，由SEQIDNO:2中第499-531位核巧酸编码；第178-184位为胶原结合结构域 (CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO:2中第532-552位核巧酸编码；第185-186位为连接肤 的氨基酸序列，由SEQIDNO:2中第553-558位核巧酸编码。SEQIDNO:6所示的的蛋白包括192个氨基酸，除了含有SEQIDNO:5所示的氨基 酸W外，还含有组氨酸标签，其由SEQIDNO:3编码，其中，第1-166位为IFNA的氨基酸序 列，由SEQIDNO:3中第1-498位核巧酸编码；第167-177位连接肤的氨基酸序列，由SEQ IDNO:3中第499-531位核巧酸编码；第178-184位为胶原结合结构域（CBD)的氨基酸序 列，由SEQIDNO:3中第532-552位核巧酸编码；第185-186位为连接肤的氨基酸序列，由 沈QIDNO:3中第553-558位核巧酸编码；第187-192位为组氨酸标签，由沈QIDNO:3中 第559-576位核巧酸编码。 本专利技术还提供了一种制备前述干扰素A化与胶原结合结构域的融合蛋白的方法， 包含如下步骤： i、取前述的重组大肠杆菌组菌，接种到LB培养基上，37°C、200r/min培养12h，得 菌液；ii、取步骤i的菌液按2ml:100ml的接种量转接至LB培养基中，37°C、200r/min 培养，至0D600值达到0. 8~1时，加入IPTG至终浓度为Immol/l，诱导表达地；[001引扯、离心得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。 步骤化中，所述分离纯化采用His-tag磁珠纯化试剂盒分离纯化。 本专利技术还提供了前述核巧酸序列重组载体、重组菌、干扰素A2b与胶原结合结构 域的融合蛋白在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。 优选地，所述制剂为缓释制剂。 进一步优选地，所述缓释制剂的辅料为胶原，其中，融合蛋白与胶原的重量比为融 合蛋白与胶原的重量比为138:1000。 进一步优选地，所述胶原为I型胶原。 本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，它是W前述核巧酸序列、重组载体、重组菌和/ 或干扰素A化与胶原结合结构域的融合蛋白为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而 成的制剂 与天然的干扰素A化相比，本专利技术干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白 (IFNA-CBD)更容易特异结合在肿瘤组织上，不会很快随体液扩散，相同剂量下，本专利技术干扰 素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白可W更好的抑制肿瘤组织生长，存活时间显著延长， 对肿瘤的治疗效果明显更佳，临床应用前景良好。 W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于W下的实施例。凡基于本专利技术上述内 容所实现的技术均属于本专利技术的范围。【附图说明】 图1为IFNA-CBD和IFNA蛋白结构示意图 阳02引图2为MCF-7细胞生长曲线 图3为IFNA-CBD和IFNA在体外与胶原的结合能力 图4为CH-IFNA-CBD与CH-IFNA蛋白释放曲线 图5为裸鼠荷瘤体积 图6为裸鼠生存期曲线【具体实施方式】 实验材料和仪器： DNA聚合酶（内.imeSTAR虽MaxDNAPolymerase, !"akara,日本） |；0〇35]DNA标准品（Takara，日本） DNA连接试剂盒（Takara，日本） 快速DNA产物纯化试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，中国） 高纯度质粒小抽提试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，中国） 细菌蛋白抽提试剂盒（康为世纪生物科技有限公司） 包涵体蛋白溶解液（康为世纪生物科技有限公司） 琼脂糖度lowest,西班牙） 甜aI限制性内切酶（肥B，美国） W45] 化OI限制性内切酶（肥B，美国） 大肠杆菌感受态细胞株Tran巧a(全式金生物技术有限公司，中国） 本文档来自技高网...
【技术保护点】
SEQ ID NO：1～3任意一项所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：解慧琪，胡骏亘，龚梅，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51
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