细胞培养方法技术

在35.1‑36.5℃和/或pH 7.15‑7.20和/或10％以下的溶解CO2浓度下，培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞比如CHO或者BHK细胞。优选异源蛋白质是因子VIII、ADAMTS‑13、弗林蛋白酶或因子VII。

Cell culture method

In the 35.1 36.5 DEG C and / or pH 7.15 7.20 and / or 10% of the dissolved CO2 concentration, cultured mammalian cells secrete heterologous proteins such as CHO or BHK cells. Optimization of heterologous protein is 13 ADAMTS, factor VIII, factor VII protease or Flynn.

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2008年12月22日、申请号为200880123254.5(国际申请号为PCT/US2008/088036)、名称为“细胞培养方法”的专利技术专利申请的分案申请。本申请要求申请日为2007年12月27日的美国临时申请No.61/009,328的优先权，在此将其全部内容并入本文以作为参考。
本专利技术涉及培养哺乳动物细胞、特别是可分泌异源和/或重组体蛋白的哺乳动物细胞、更具体地讲是可分泌血液蛋白质比如凝血因子VIII(在下文中称为“因子VIII”、或仅称为“FVIII”)、ADAMTS-13、弗林蛋白酶或凝血因子VII(在下文称为“因子VII”、或仅称为“FVII”)的哺乳动物细胞的方法。
技术介绍
凝血因子VIII是在哺乳动物中发现的微量血浆糖蛋白，并且在因子X的活化中作为IXa的辅因子被包含。因子VIII的遗传性缺乏导致出血病症A型血友病，该疾病能够用纯化的因子VIII成功地治疗。该因子VIII能够由血浆中萃取出来，或者能够通过基于重组DNA的技术而制备。在血浆中，其作为与von Willebrand因子(vWF)的复合物而循环。重组因子VIII(rFVIII)能够被用载有编码因子VIII分子的DNA序列的载体转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产。某些情况下，重组因子VIII与重组von Willebrand因子(rvwf)一起被共同产生，后者可稳定因子VIII。这种共同生产可能涉及到表达FVIII和VWF的各个细胞系的共培养、或者两种蛋白质在相同细胞中的共表达。参见US 5 250 421(遗传学研究所)和Kaufman等((1989)Mol.Cell.Biol.9,1233-1242)。在用于制备重组体因子VIII的典型方法中，细胞在培养基中培养并且将因子VIII分泌入培养基中。然后因子FVIII可以，任选地作为与vWF的复合物，被从培养基中纯化出来。由于在本
已知的方法中得到相对低的产率，所以重组因子VIII的生产是昂贵的。单位细胞产量与可以得到的其他重组体蛋白的产量相比趋于较低。如果培养基不补充动物产品比如血清，培养基可能仅支持相对低的细胞密度。这会降低单位体积培养基的产量。然而，人们期望不用动物产品来补充培养基，以便降低病毒及其他可传染性试剂的污染风险。用于生产FVIII的无动物蛋白培养基已知例如被US 6 936 441(巴克斯特公司)报道了。本专利技术提供了用于生产血液蛋白质包括rFVIII的方法，其中产率与本
已知的方法相比得到了提高。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面提供了一种在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中该细胞培养上清液保持在设定在X±0.9℃的温度下，其中X为35.1至36.5的值，附带条件是温度被设定为低于37℃。本专利技术的第二个方面提供了一种在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中，该细胞培养上清液被保持在设定为X±0.05的pH，其中X为7.15至7.20的值，附带条件是pH被设定为大于7.10。本专利技术的第三个方面提供了一种在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中该细胞培养上清液的CO2浓度为1-10％。本专利技术的第四个方面提供了一种在包含细胞培养上清液的容器中连续培养分泌FVIII的哺乳动物细胞的方法，其中，在细胞培养上清液中的细胞密度通过在线(in-line)传感器测量，并且新鲜培养基进入容器的流入量被自动地控制，从而保持细胞的密度在期望的范围内。具体实施方式在本专利技术第一个方面的过程中，其中哺乳动物细胞被培养的细胞培养上清液被保持在设定为X±0.9℃的温度下，其中X为35.1至36.5的值，附带条件是温度被设定为低于37℃。在优选的实施方式中，温度被设定为36±0.9℃、优选36±0.5℃、更优选36±0.2℃，并且最优选36℃；或者35.1±0.9℃、优选35.1±0.5℃、更优选35.1±0.2℃，并且最优选35.1℃；或者36.5±0.9℃、36.5±0.5℃、更优选36.5±0.2℃，并且最优选36.5℃。术语“细胞培养上清液”是在其中培养哺乳动物细胞的培养基。该培养基不允许被与可能被加至培养物中的补料培养基相混，虽然补料培养基也优选在为细胞培养上清液所设置的温度处被加至培养物中。术语“培养物”，我们是指细胞培养上清液和在其中培养的哺乳动物细胞。通常，在37℃下培养哺乳动物细胞。令人惊讶的是，申请人发现，在较低温度比如36℃下培养哺乳动物细胞可提高重组体蛋白的产率。术语“培养”或“保持”的温度，我们指的是过程控制系统所设置的温度，换句话说，是预期的、目标温度。显然，随时间过去、以及在培养容器中从一个位置到另一个位置，培养物的温度将有小的变化。在此我们述及的“培养”或“保持”的设定为X±Y℃的温度，我们指的是设置值为从X+Y℃至X-Y℃。如此，例如，其中X是36.0±0.9℃，设定值被设定为从35.1到36.9的值。对于X的每一个优选值，设定值是在X±0.9℃、±0.8℃、±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、或者±0.1℃的范围内。优选较窄的范围。X的一个设定值是最优选的。对于任何给定的设定值，可以发生轻微的温度变化。典型地，可以发生这种变化，因为加热和冷却装置仅在温度已经稍微偏离设定值之后才被启动。在该情形中，视情况而定，设定值是X(±Y)，并且当温度变化±Z℃时启动加热或冷却装置。典型地，温度在加热或冷却装置被启动之前偏离设定值的可允许的偏差度可以被过程控制系统编程。温度可以被受恒温器控制的加热和冷却装置控制到最接近±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃或甚至±0.1℃。较大的温度差别也可以被编程，比如±0.9℃、±0.8℃、±0.7℃或±0.6℃。温度也可以受培养容器在特定温度的加热池中的浸没情况所控制。可信地，因为不断地采用加热，没有偏离设定值。由于细胞培养上清液的温度测量误差，所以产生了另一个变化起源。在细胞培养设备中使用的典型温度计可以具有±0.3℃或±0.2℃、甚至±0.1℃的变化。若设定值被设定为在X±Y℃范围内的值，并且温度的容许偏差是±Z℃(即，视情况而定，当温度偏离±Z℃时，加热器或冷却器被启动)，则这还可以表示为(X-Y至X+Y)±Z℃的设定值。对于每个可能的X值，如上所述，可想到±Y℃与±Z℃的所有组合，附带条件是温度被设定为低于37℃。在一个优选的实施方式中，温度被设定为36±Y℃。优选温度被设定为(35.4-36.6)±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.5-36.5)±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.6-36.4)±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.7-36.3)±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.8-36.2)±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.9-36.1)±0.8℃、±0.7℃±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者36±0.9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其包括在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞，其特征在于，所述细胞培养上清液被保持在设定为36±0.5℃的温度，其中细胞培养是连续培养，且所述连续培养维持在细胞密度为1.6×106至2.6×106个细胞/ml，所述异源蛋白质是FVIII，并且其中哺乳动物细胞是CHO细胞。

【技术特征摘要】
2007.12.27 US 61/009,3281.一种方法，其包括在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞，其特征在于，所述细胞培养上清液被保持在设定为36±0.5℃的温度，其中细胞培养是连续培养，且所述连续培养维持在细胞密度为1.6×106至2.6×106个细胞/ml，所述异源蛋白质是FVIII，并且其中哺乳动物细胞是CHO细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温度被设定为36±0.2℃。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温度被设定为36℃。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温度被设定为36.5℃。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养上清液被保持在设定为X±0.05的pH，其中X为7.15至7.20之间的值，附带条件是所述pH被设定为大于7.10。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.20±0.05。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.20±0.03。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.20±0.01。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.20。10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.15±0.05。11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.15±0.03。12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH被设定为7.15±0.01。13.如权利要求5所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈·乔万尼奥里，西维亚·罗伊，薇洛妮克·杜克洛，维吉妮·夏洛特，伊夫奥利维耶·斯托弗，
申请(专利权)人：百深有限责任公司，百深公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH