一种酶催化合成谷胱甘肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶催化合成谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：S1、将γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再将混合液A与乙酸激酶液混合，得混合液B；S2、在混合液B中加入固定化载体，搅拌固定化，过滤得固定化酶；S3、将谷氨酸、L‑半胱氨酸、甘氨酸、硫酸镁、ATP、乙酰磷酸配成反应液，加入固定化酶，搅拌反应；S4、反应完成后，过滤反应液，滤液经提取精制成谷胱甘肽。本发明专利技术的方法合成效率高：反应液产品含量达到10g/L以上，底物转化率达到90%以上；通过引入乙酸激酶构建ATP再生偶联系统，大幅减低ATP的投料量，明显减低生产成本；固定化酶可以重复利用，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备谷胱甘肽的方法，特别涉及一种酶催化合成谷胱甘肽的方法。
技术介绍
谷胱甘肽（GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸缩合而成的一种含γ-2谷氨酰基和巯基的生物活性三肽类化合物，在蛋白质和DNA的合成、氨基酸的转运、细胞的保护等重要的生物学现象中起着直接或间接作用。它主要分布于动物、植物、微生物细胞中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并已成为医学重要的具有调节人体免疫功能和辅助抗癌的药物之一。GSH的抗氧化性又使它在食品工业中的应用备受人们关注，在食品贮藏保鲜和改善产品风味、提高产品营养价值方面的作用越来越被看好。目前，谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法以及酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已较少使用。化学合成法成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂，于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，且存在环境污染等问题，难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法，原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂。与前几种方法相比，酶法具有催化专一性强、反应条件温和、转化效率高等优点。酶法生产谷胱甘肽是利用合成谷胱甘肽所需的关键酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽合成酶催化，同时添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸等底物，并添加少量三磷酸腺苷来合成谷胱甘肽。目前，微生物酶法生产谷胱甘肽所面临的问题主要有胞壁或生物膜造成的传质阻碍以及持续有效的ATP能量供应体系。GSH的合成伴随着ATP的消耗（合成1M GSH需消耗2M ATP），由于ATP价格昂贵，直接添加ATP显著增加了酶法合成GSH的成本，并且高浓度的ATP及其代谢产物ADP的存在还会强烈抑制GSH合成酶的活性，因此目前酶法生产GSH都采用ATP再生，主要采用酵母细胞再生的方式。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质，给进一步纯化增加难度，使用酶系再生ATP是近年来的研究方向。固定化酶是一种将酶固定于载体上的技术。一般地，经过固定化的酶本身还是溶于水的，只是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶的流动性降低。目前固定后的酶虽然稳定性增加，易从反应系统中分离，便于运输和贮存，但是活性降低。由于上述原因，迫切需要突破酶法生产GSH的瓶颈，开发相应的酶催化合成谷胱甘肽的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶催化合成谷胱甘肽的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种酶催化合成谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：S1、将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再将混合液A与乙酸激酶液混合，得混合液B；S2、在混合液B中加入固定化载体，搅拌固定化，过滤得固定化酶；S3、将谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、硫酸镁、ATP、乙酰磷酸配成反应液，加入固定化酶，搅拌反应；S4、反应完成后，过滤反应液，滤液经提取精制成谷胱甘肽。进一步地，所述混合液A由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1：0.3~1的比例混合而得。进一步地，所述混合液B由混合液A与乙酸激酶液按酶蛋白量1：0.5~2的比例混合而得。进一步地，所述固定化载体为甲壳胺-硅胶复合物。进一步地，所述固定化载体按照以下方法制备：称取1重量份甲壳胺加入100~200重量份的0.5~2wt%醋酸溶液中，搅拌溶解，再加入5~20重量份粒径为0.1~0.5mm的硅胶颗粒，搅拌8~15h，过滤后加入80~120重量份0.5~1mol/L氢氧化钠溶液浸泡1~3h，使甲壳胺和硅胶颗粒均匀结合在一起，过滤并用纯化水清洗至中性，加入80~120重量份的1~3wt%戊二醛溶液，搅拌2~5h，进行交联反应和活化甲壳胺基团，过滤后用纯化水清洗2~3次得到甲壳胺-硅胶复合物。进一步地，所述固定化载体的用量是：每20~50mg蛋白加入1g固定化载体。进一步地，步骤S2所述搅拌固定化的条件是：温度2~10℃，时间1~5h。进一步地，所述反应液的配方是：谷氨酸20~60mmol/L、L-半胱氨酸20~60mmol/L、甘氨酸20~60mmol/L、硫酸镁5~10mmol/L、ATP5~10mmol/L、乙酰磷酸40~100mmol/L；所述固定化酶的用量是10~50g/L。进一步地，步骤S3所述搅拌反应的条件是：用氢氧化钠调节反应液pH为5.0~8.0，反应温度25~35℃，反应时间2~6h。本专利技术设计了一种固定化酶催化合成谷胱甘肽的工艺方法，其特点是把γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和乙酸激酶三种酶混合固定化在同一载体上，所得固定化酶与氨基酸、ATP等底物投入到反应器，一步合成谷胱甘肽。本专利技术具有以下有益效果：1、合成效率高：合成时间大幅降低至2~6h，在优选条件下反应液产品含量达到10g/L以上，底物转化率（以L-半胱氨酸计算）达到90%以上。2、降低成本：本专利技术的固定化酶含3个酶蛋白，其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶实现合成谷胱甘肽功能，乙酸激酶实现ATP再生利用功能，通过引入乙酸激酶构建ATP再生偶联系统，大幅减低ATP的投料量，明显减低生产成本。3、工艺简化：相比于发酵法和现有的酶催化合成法，本专利技术采用固定化酶一步催化合成谷胱甘肽，合成后反应液经过简单的固液分离后，产品液不残留菌体、酶蛋白、宿主菌DNA或蛋白质等，只要经过简单的提取步骤即可获得高质量的精制品。4、环保节能：合成条件温和，常温常压，反应时间短，节能降耗效果明显，工艺过程产生三废非常少，不影响车间和周边环境。5、固定化酶可以重复利用，而且稳定性好，连续50批次使用后，固定化酶的酶活损失不足10%。6、固定化载体为自制甲壳胺-硅胶复合载体，价格低廉，而且具有更好的固酶效果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明：以下实施例所用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、乙酸激酶由基因工程菌发酵表达相应的酶蛋白，然后经过镍柱提取纯化后获得高纯度的酶蛋白。实施例1按照以下步骤合成谷胱甘肽：1、将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1：1的比例混合，得混合液A，再将混合液A与乙酸激酶液按酶蛋白量1：1的比例混合，得混合液B；2、在混合液B中加入固定化载体，搅拌固定化，条件是：温度5℃，时间3h，过滤得固定化酶；固定化载体的用量是：每40mg蛋白加入1g固定化载体；固定化载体按照以下方法制备：称取1重量份甲壳胺加入150重量份的1wt%醋酸溶液中，搅拌溶解，再加入10重量份粒径为0.1~0.5mm的硅胶颗粒，搅拌12h，过滤后加入100重量份0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡2h，使甲壳胺和硅胶颗粒均匀结合在一起，过滤并用纯化水清洗至中性，加入100重量份的2wt%戊二醛溶液，搅拌4h，进行交联反应和活化甲壳胺基团，过滤后用纯化水清洗2~3次得到甲壳胺-硅胶复合物，通过交联后甲壳胺-硅胶复合物机械强度大幅提高，活化后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶催化合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再将混合液A与乙酸激酶液混合，得混合液B；S2、在混合液B中加入固定化载体，搅拌固定化，过滤得固定化酶；S3、将谷氨酸、L‑半胱氨酸、甘氨酸、硫酸镁、ATP、乙酰磷酸配成反应液，加入固定化酶，搅拌反应；S4、反应完成后，过滤反应液，滤液经提取精制成谷胱甘肽。

【技术特征摘要】
1.一种酶催化合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再将混合液A与乙酸激酶液混合，得混合液B；S2、在混合液B中加入固定化载体，搅拌固定化，过滤得固定化酶；S3、将谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、硫酸镁、ATP、乙酰磷酸配成反应液，加入固定化酶，搅拌反应；S4、反应完成后，过滤反应液，滤液经提取精制成谷胱甘肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液A由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1：0.3~1的比例混合而得。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液B由混合液A与乙酸激酶液按酶蛋白量1：0.5~2的比例混合而得。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化载体为甲壳胺-硅胶复合物。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化载体按照以下方法制备：称取1重量份甲壳胺加入100~200重量份的0.5~2wt%醋酸溶液中，搅拌溶解，再加入5~20重量份粒径为0.1~0.5mm的硅胶颗粒，搅拌8~15...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘桂祯，黄炯威，周华润，莫世艺，劳伟明，梁剑锋，
申请(专利权)人：开平牵牛生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44