本发明专利技术公开了一种谷胱甘肽的生产发酵工艺，采用ＣＣＴＣＣ Ｍ２０７１９２的为发酵菌株，接种于种子培养基摇瓶培养后，再接种于富含硫酸盐的发酵培养基中进行培养，在通气，搅拌下，２８～３０℃，发酵培养一定时间后再补加一定量Ｌ－半胱氨酸、Ｌ－甘氨酸、Ｌ－谷氨酸的前体以提高产品谷胱甘肽的合成速度和产量。本发明专利技术的谷胱甘肽的生产发酵工艺具有培养成本低、生物积累量高的优点，大规模发酵可以得到极高的细胞密度和生物转化率，这将大大有利于实现发酵法制备谷胱甘肽的产业化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及工业微生物领域，具体涉及谷胱甘肽生产菌株发酵工艺。技术背景谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，由于其具有多种重要的 生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用，在临床 医药、食品工业、体育运动及有关生物研究领域有着广泛的用途(Sies H (1999). Glutathione and its role in cellular fiinctions. Free Rad Biol Med. 27, 916-921;郑云朗. (1995).谷胱甘肽的生物学功能.生物学通报30， 22-24)。自20世纪70年代起，国外 发酵生产GSH方面进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关的专 利(陈坚，卫功元，李寅等(2004)微生物发酵法生产谷胱甘肽，无锡轻工大学学报， 23.104108; US Patent 6902912; US Patent 4598046; US Patent 4582801; JP19890032584; WO2004/003217A1; EP1539982; US Patent 20050239164)。但在实际的发酵生产中， 性能优良的菌种仅仅是一个开始；获得可以得到培养低成本、生物积累量高，大规模发 酵极高的细胞密度和生物转化率的工艺，同样是实现GSH工业化生产所需要解决的关 键问题；而这方面的研究大都是从20世纪90年代以后开始的，主要包括营养与环境 条件优化、发酵过程控制以及前体物质的添加等内容(陈坚，卫功元，李寅等(2004)微 生物发酵法生产谷胱甘肽，无锡轻工大学学报，23.104108)。发酵生产GSH—般在发 酵过程中添加三种氨基酸前体以提高产量(陈坚，卫功元，李寅等(2004)微生物发酵法 生产谷胱甘肽，无锡轻工大学学报，23.104108)。三种氨基酸前体之一的半胱氨酸最为 重要，它的供应与利用直接影响GSH的产量(CatalinoG.A.， Akihi幼K.， ToruS. et al. (1991) Appl Microbiol Biotechnol.， 6: 538-540; WEN, S.， T. ZHANG and T. TAN(2004) Enzyme Microb. Technol. 35: 501-507)。半胱氨酸与甘氨酸、谷氨酸相比价格较贵。GSH 的生产中如果增加细胞内的半胱氨酸含量、就可以减少外源半胱氨酸添加量，生产成本 将会大大降低。因此，增加细胞内的半胱氨酸含量，减少发酵GSH前体添加量，获得 培养低成本、生物积累量高，大规模发酵极高的细胞密度和生物转化率的工艺是发酵发 酵生产谷胱甘肽产业化的前提。为此，我们做了很多这方面的研究，开发了一种谷胱甘肽生产菌株，其导入了 GSH 相关合成酶Y-L-谷氨酰—L-半胱氨酸合成酶基因GSH I与谷胱甘肽合成酶基因GSH II， 以及半胱氨酸相关合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚一？裂解酶CYS4基因。该 菌株是甲醇利用型酵母，它的种属为Pichiapastoris，基因型为GS115 ，菌株保藏号为CCTCC M 207192,日期2007年12 月6日；保藏地点为武汉，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。并申请 了专利"一种谷胱甘肽生产菌株及其构建方法"(200710192345.1)。该菌株具有细胞内 能够产生大量GSH相关合成酶、半胱氨酸相关合成酶，增加半胱氨酸在细胞体内合成 量的途径，从而使细胞内合成大量GSH的特点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用上述甲醇利用型酵母CCTCC M 207192生产谷胱甘肽的高产量、低成本的发酵工艺。为解决上述技术问题，本专利技术的思路是甲醇利用型酵母CCTCC M 207192具有细胞 内能够产生大量GSH相关合成酶、半胱氨酸相关合成酶，增加半胱氨酸在细胞体内合 成量的途径，从而使细胞内合成大量GSH的特点。因此，发酵培养选择在硫酸盐含量 丰富培养基中培养，有可能使酵母菌细胞内硫元素的同化代谢流流向半胱氨酸的合成， 提高胞内半胱氨酸的含量，减少外源半胱氨酸的供给量，降低GSH的合成生产成本， 同时选择合适的时机添加GSH前体可以提高谷胱甘肽的合成速度和产量。具体技术方案如下一种谷胱甘肽的生产发酵工艺，采用甲醇利用型酵母CCTCC M 207192为发酵菌 株，经种子培养和预发酵培养后，接种在富含硫酸盐的发酵培养基中，在DO2(M0n/" 28~30°C、 pH5.0~6.0、发酵培养基中的甘油的重量百分比为1~2%的条件下进行发酵罐 培养，当发酵OD达到250~350时，补加谷胱甘肽的前体L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，控制发酵液中谷胱甘肽每种前体的浓度为540mmol/L，继续培养到单位体积 谷胱甘肽量不再增加为止。其中，所述的富含硫酸盐的发酵培养基组成为10g/L酵母抽提物，10g/L玉米浆、 10g/L甘油，10 30g/L硫酸铵，6g/L磷酸二氨钾，0.5g/L氯化钠，5g/L硫酸镁，2mL/L 微量元素溶液，pH5.0~6.0。其中，所述的微量元素溶液按如下方式配制1L的微量元 素溶液是将0.07g MnSO4'H20， 0.4g CoCi2'6H20， 0.2g FeS04H20， 0.2g ZnCl2， O.lg CuS04'5H20, 0.05gH3BO4， 1.5g CaCl2溶解于浓硫酸中。其中，发酵罐培养过程中的接种量为5~10% (v/v)。其中，通过调节通气量1.0~2.5m3/h、搅拌转速400~900rpm、罐压0.05~0.08 Mpa 等控制DO为2040%。其中，通过流加氨水控制pH值。其中，发酵中后期流加谷胱甘肽的前体为L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，每 种前体流加液浓度为4mol/L。以上，调节本专利技术DO值和pH值的操作为本
常规技术，任何本
技术人员都可实现。有益效果本专利技术的谷胱甘肽的生产发酵工艺利用甲醇利用型酵母CCTCC M 207192具有培养低成本、生物积累量高、大规模发酵可以得到极高的细胞密度和生物转 化率的特点，通过工艺控制使细胞内合成大量GSH。本专利技术在富含硫酸盐的发酵基质中 培养CCTCCM 207192,并流加L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸等前体，GSH产量达 到6.5g/L以上，达细胞干重的3%以上(图l)，明显具有工业化的前景。 附图说明图l为GSH含量随发酵时间的变化曲线。 具体实施例方式本专利技术可以通过下述实施例进一步阐明。 实验材料和方法简要说明1、 菌株以及主要试剂菌株为甲醇酵母CCTCC M 207192;蛋白胨(Tryptone)、酵母抽提物(Yeast Extract) 购自Oxoid公司；工业级酵母抽提物购于安琪酵母股份公司；HPLC使用试剂购于江苏 汉邦，其余试剂为国产试剂。2、 发酵液中甘油含量测定 (1)试剂与标准溶液的配制Nash试剂精确称取乙酸按150g，蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酞丙酮， 定容至1000mL。0.015 mol/L高碘酸钠溶液:精确称取高碘酸钠3.2 g，溶于0.12 mol/L的HCl，定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于采用甲醇利用型酵母ＣＣＴＣＣ Ｍ２０７１９２为发酵菌株，经种子培养和预发酵培养后，接种在富含硫酸盐的发酵培养基中，在ＤＯ２０～４０％、２８～３０℃、ｐＨ５．０～６．０、发酵培养基中的甘油的重量百分比为１～２％的条件下进行发酵罐培养，当发酵液ＯＤ达到２５０～３５０时，补加谷胱甘肽的前体Ｌ－半胱氨酸、Ｌ－甘氨酸和Ｌ－谷氨酸，控制发酵液中谷胱甘肽每种前体的浓度为５～４０ｍｍｏｌ／Ｌ，继续培养到单位体积谷胱甘肽量不再增加为止。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金大勇，许善峰，蔡宇杰，
申请(专利权)人：南京华锦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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