高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a制造技术

本发明专利技术涉及一种南极海水分离筛选得到的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株ｎ２ａ，是芽孢杆菌属的Ｂａｃｉｌｌｕｓ的新菌种，该菌株保藏于ＣＣＴＣＣ，保藏号为ＣＣＴＣＣＮｏ：Ｍ２０７０７９，过氧化氢酶活性达１２００Ｕ／ｍｇ，将在工业和医疗等领域有着广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋微生物领域，特别是涉及从南极海水中分离筛选出高产低温过氧 化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a及其产生的低温过氧化氢酶。技术背景南极海域由于气候特别寒冷，环境极其恶劣，所以动植物种类较少，但却有大量的 原核生物，低温微生物资源丰富。低温酶是维持低温条件下细胞生命活动合适的生化反 应速率的关键，筛选低温酶高产菌株是低温微生物理论与应用研究的基础。过氧化氢酶是好氧微生物生命活动中的重要持家蛋白。它迅速清除在生物代谢过程 的氧化还原反应中产生的强氧化剂HA，防止其穿过细胞内结构、氧化蛋白质或断裂核 酸单链伤害细胞。近年来它又以高效催化的能力在工业和医疗等领域展现出广阔的应用 前景。所以低温过氧化氢酶作为生物抗氧化保护剂对好氧低温微生物生命活动有重要意 义，也是有潜在工业应用价值的低温酶。Hernandez曾报道南极海水细菌在50 ii mol/L H202的条件下仍能正常生长，说明有 可能南极海水中存在高过氧化氢酶活性的菌种。Yumoto等人和Lorentzen等人分别报道了来自K/6i"io i"i/y7 w'e/7w's和Kz力rio sa^w/^ciA的高活性低温过氧化氢酶，但来自天然环境自由生活的高活性低温过氧化 氢酶的微生物尚无报道，高过氧化氢酶活性的海洋革兰氏阳性菌也无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于寻找生存在自然环境中特别是在极端低温条件下高产高活性低 温过氧化氢酶的微生物，经专利技术人广泛深入开发研究，在对南极海水中低温微生物进行 分离筛选基础上，获得一株具有高效催化能力的生物抗氧化保护剂的高产高活性低温过 氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp. n2a (简称菌株n2a)。本专利技术提供的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp. n2a是从南极海水中分离筛选获得的高产高活性低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株 Bacillus sp. n2a，根据南极海洋微生物菌株Bacillus sp. n2a和相关菌株的16SrDNA 系统发育树(图l)以及菌株n2a的16SrDNA序列相似性最高的菌株分别为 Bacillus barbaricus DSM 147301 (98.8%)，Bacillus arsenicus DSM 15822T (97.5%)， Bacillus macauensis DSM 17262T (96.4%)， Bacillus gelatini LMG 21880T (95.1%)。经16SrDNA基因测序(GenBanK accession number DQ508485)鉴定确定为芽孢杆 菌属的细菌，是Bacillus的新菌种。该高产低温过氧化氢酶南极海洋微生物菌株 Bacillus sp. n2a于2007年6月9日保藏在地址位于中国武汉"武汉大学"，邮编-430072的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNo: M207079。本专利技术提供的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillus sp. n2a的形 态与生理生化特征为形态特征-菌株n2a为芽孢杆菌，长2.5-5um，宽0.5-lum，卵圆形芽孢端生。 培养特征-在基础海水培养基中(所述基础海水培养基为5克蛋白胨和1克酵母膏溶于1升海 水，pH7.5， 12rC灭菌20分钟)于4'C 40。C的温度下生长，其最适生长温度范围为20 °C 30 。C，生长pH范围为pH6 11，最适生长的NaCl浓度为0% 6%，当NaCl浓度 大于8%时生长被抑制。3(TC基础海水培养基培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径 0.9至L2mm，光滑有光泽，粘液状外观，质地似奶油，白色半透明。生理生化特征菌株n2a的生理生化特征列表1。表l<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>菌株n2a具有杆菌形态和产芽孢能力这两种芽孢杆菌属的重要特征。 菌株表型特征菌株n2a与系统发育相关菌种的表型特征的差异列于表2 表2<table>table see original document page 8</column></row><table>注 1,菌株n2a: 2, Bacillus barbaricus ; 3, Bacillus arsenicus; 4, Bacillus macauensis; 5' Bacillus gelatini。 +; 正负 ND: 未测定v: 可变；w: 弱。从表2可见菌株n2a在低温生长、耐盐性等方面明显有别于16SrDNA系统发育学 相关菌株，菌株n2a的表型5'C生长，7% NaCl生长。菌株n2a与系统发育相关菌种的脂肪酸含量(%)列于表3。表3<table>table see original document page 8</column></row><table>注1， n2a; 2， Bacillus barbaricus; 3， Bacillus arsenicus; 4, Bacillus macauensis; 5, Bacillus gelatini。由表3可见菌株n2a的支链脂肪酸占优势，即不饱和脂肪酸占40%以上，体现出低温 海洋菌的特征，这完全符合芽孢杆菌属细菌的特征。但菌株n2a的C14、 C15和C16三类主要脂肪酸含量相差不大(20%至30%)，这明显不同于系统发育学相关菌株(其C15或C16— 种脂肪酸占优势)。菌株n2a的不饱和脂肪酸含量超过40W，明显高于16SrDNA系统发育学相关菌株，这 也是低温菌的重要特征。 菌株n2a的培养初筛含1.5% (w/v)琼脂的基础海水培养基灭菌后冷却至5(TC加入H202，使终浓 度达lmmol/L，倒平板。以200yL海水样品(例如南极中山站附近海水)涂布，15。C培 养10天，长出的单菌落划斜面保藏。复筛初筛获得的菌株从斜面接入250mL摇瓶(含20mL基础海水培养基)，200rpm， 20'C培养24h,离心收菌体，以pH7. 5， 50mraol/LTris-Cl重悬菌体并在冰浴中超声破碎， 离心后取上清液测活性和蛋白。过氧化氢酶活性以HA在240nm处分解速率计算。H202 摩尔吸光系数为43. 6(mol/L)—'cm—'， 1个活力单位定义为5'C每分钟分解1 u molHA的酶 量。蛋白含量测定采用Bradford法。以7e/7t^s和i&c力er/c力j'a coh'为对照筛选高 活性菌株。初筛平板细菌生长缓慢，7天后出现肉眼可见的菌落。所有单菌落复筛后获得一株 高活性菌株n2a ，其菌体超声破碎液过氧化氢酶活性达1200U/mg，而必7e/7^/s和A 的菌体超声破碎液中酶活性分别为900U/mg和70U/mg 。菌株n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株ｎ２ａ，其特征在于是从南极海水中分离获得的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．ｎ２ａ，是芽孢杆菌属的Ｂａｃｉｌｌｕｓ的新菌种，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为ＣＣＴＣＣ　　Ｎｏ：Ｍ２０７０７９。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙谧，郝建华，王伟，袁翠，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]