一种发酵生产卡那霉素的方法技术

本发明专利技术涉及一种发酵生产卡那霉素的方法，包括如下步骤：(1)取卡那链霉菌生产菌株，制备种子液；(2)将种子液接种于发酵培养基中，在温度26～28℃、湿度30～60％、溶氧55～80mg/L的条件下发酵培养30～40h，然后加入玉米蛋白粉，继续发酵培养30～80h，制得含有卡那霉素的发酵液。本发明专利技术通过调整发酵培养基组分，并通过在发酵培养过程中的特定时间段加入玉米蛋白粉，从而使得卡那霉素发酵单位大幅度提高，培养完成后发酵效价可达到12600U/ml。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种发酵生产卡那霉素的方法，属于微生物发酵

技术介绍
卡那霉素是一种由卡那链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，含三个组分：卡那霉素A、B和C，卡那霉素A为主要组分，因其抗菌谱广，毒副作用小，使用范围越来越广，卡那霉素主要与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质合成，从而达到杀菌的作用。卡那霉素主要以其衍生物丁胺卡那霉素，被广泛应用于临床，是青霉素过敏者最佳的替代药品，成本低廉、疗效好；卡那霉素还被广泛制作成单硫酸卡那霉素用于动物的杀菌，其对多数肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属等均有良好抗菌作用；用于治疗血液和组织感染等炎症。目前对微生物发酵法生产卡那霉素的研究主要是菌种选育和发酵条件优化两个方面，同时提取方面也进行了大量的研究工作。如中国专利文献CN103614330A(申请号201310621533.7)公开了高产卡那霉素B基因工程菌及其构建和应用。目前，四川抗生素研究所通过大量的研究性工作，以及长期的菌种筛选和工艺探索，发酵效价最高可以达到10000U/mL。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种发酵生产卡那霉素的方法。本专利技术的技术方案如下：一种发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取卡那链霉菌生产菌株，制备菌体浓度为107～109cfu/ml的种子液；(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比5～8％接种于发酵培养基中，在温度26～28℃、湿度30～60％、溶氧55～80mg/L的条件下发酵培养30～40h，然后加入发酵液体积1.0％～1.5％的玉米蛋白粉，继续发酵培养30～80h，制得含有卡那霉素的发酵液；所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：玉米淀粉9.00～14.00％、淀粉酶0.10～0.20％、葡萄糖0.10～1.00％、冷榨豆饼粉2.00～4.00％、豆粕粉2.00～4.00％、氯化钠0.10～0.20％、硝酸钠0.08～1.60％、硫酸锌0.02～0.06％、硫酸亚铁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.02％，余量水，pH自然。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中卡那链霉菌生产菌株选自：卡那链霉菌，编号为KN14-36。该菌株为本领域常用菌株，可由沈阳药科大学购买获得；其他卡那链霉菌菌株经本专利技术的技术方案也可获得相似的技术效果。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中种子液的制备步骤如下：(i)将卡那链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的砂土孢子接种量为0.008～0.012g，在温度26～28℃、湿度30～60％的条件下培养96～168h，制得斜面孢子；(ii)将步骤(i)制得的斜面孢子按6.25～12.5cm2/L的接种量接种于种瓶培养基中，在温度26～28℃、湿度30～60％、220～240rpm的条件下培养24～40h，制得菌体浓度为107～109cfu/ml的种子液。进一步优选的，所述步骤(i)中，斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.2～2.6％、酵母粉0.1～0.3％、葡萄糖0.8～1.2％、蛋白胨0.4～0.6％、氯化钠0.4～0.6％、牛肉膏0.2～0.4％，余量水，pH自然。砂土孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。进一步优选的，所述步骤(i)中，培养湿度为40～50％，培养时间为115h。该条件下培养获得的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。进一步优选的，所述步骤(ii)中，种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：玉米淀粉3.00～6.00％、葡萄糖0.40～0.80％、冷榨豆饼粉3.00～6.00％、氯化钠0.20～0.40％、硝酸钠0.30～0.60％、硫酸锌0.005～0.020％、碳酸钙0.05～0.15％，余量水，pH自然。斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检次生菌丝大量繁殖成网状，开始变细，美兰染色由深变浅，达到优良种子液标准。进一步优选的，所述步骤(ii)中，种瓶培养基装于750mL摇瓶中，装液量为80mL。进一步优选的，所述步骤(ii)中，湿度为40～50％，转速为220rpm，培养的时间为28h。该条件下培养获得的次生菌丝大量繁殖成网状，达到优良种子标准。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，淀粉酶酶活为2500～3500U/g。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，发酵培养的湿度为40～50％，溶氧70mg/L发酵培养时间35h，继续发酵培养时间80h。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，玉米蛋白粉的加入量为发酵液体积的1.2％。有益效果本专利技术通过调整发酵培养基组分，并通过在发酵培养过程中的特定时间段加入玉米蛋白粉，从而使得卡那霉素发酵单位大幅度提高，培养完成后发酵效价可达到12600U/ml。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案做进一步详细的说明，实施例中所使用的设备均按照现有技术。原料来源淀粉酶，酶活2500～3500U/g，河北邢台万达生物工程有限公司有售；玉米蛋白粉，普通市售产品，指标符合农副产品玉米蛋白粉的行业标准；冷榨豆饼粉，普通市售产品，指标符合农副产品冷榨豆饼粉的行业标准；菌株来源卡那链霉菌KN14-36，购自沈阳药科大学。卡那霉素效价采用生物效价测定法。标准曲线制作：称取卡那霉素标准品适量于100ml容量瓶中，用无盐水定容，制成浓度为1000U/ml标准溶液，吸取1000U/ml的溶液2ml于100ml容量瓶中，加无菌水定容制成20U/ml的溶液。分别吸取20U/ml的溶液4.55、5.70、7.15、8.95、10.12、14.00、17.50、21.85ml于100ml容量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH7.8)定容制成0.91、1.14、1.43、1.79、2.24、2.80、3.50、4.37U/ml的溶液。在恒温室36～38℃培养17小时，量取抑菌圈直径，以直径为横坐标，以浓度为纵坐标，求斜率，作为发酵液生物效价测定时的参数，以浓度(C)对直径(A)进行线性回归，得回归方程为C＝KA+b，求出斜率K。发酵液的测定：准确吸取合适体积卡那霉素发酵液滤液于50ml容量瓶中，使用pH7.8的缓冲液定容，配制成2U/ml的样品溶液，吸取合适体积的上述标品溶液于50ml瓶中，使用pH7.8的缓冲液定容，制成2U/ml的标品溶液。采用一剂量法测定效价：取制备好的双碟，每份供试品用1只双碟，在间隔的3个不锈钢小钢管中滴装供样品溶液，其余3个小钢管滴装标准品溶液，滴完后，盖好陶瓦盖，在恒温室36～38℃培养10～12小时。取出双碟，测量各个抑菌圈的直径。照生物检定统计法进行可靠性测验，并计算效价。效价P(U/ml)＝P0×antlg[(T-S)/3×K]式中：P0供试品估计效价；K为斜率标准品所致抑菌圈直径之和S＝S1+S2+S3供试品所致抑菌圈直径之和T＝T1+T2+T3实施例1一种发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取卡那链霉菌生产菌株，制备菌体浓度为108cfu/ml的种子液；具体步骤如下：(i)将卡那链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的砂土孢子接种量为0.01g，在温度27℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取卡那链霉菌生产菌株，制备菌体浓度为107～109cfu/ml的种子液；(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比5～8％接种于发酵培养基中，在温度26～28℃、湿度30～60％、溶氧55～80mg/L的条件下发酵培养30～40h，然后加入发酵液体积1.0％～1.5％的玉米蛋白粉，继续发酵培养30～80h，制得含有卡那霉素的发酵液；所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：玉米淀粉9.00～14.00％、淀粉酶0.10～0.20％、葡萄糖0.10～1.00％、冷榨豆饼粉2.00～4.00％、豆粕粉2.00～4.00％、氯化钠0.10～0.20％、硝酸钠0.08～1.60％、硫酸锌0.02～0.06％、硫酸亚铁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.02％，余量水，pH自然。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取卡那链霉菌生产菌株，制备菌体浓度为107～109cfu/ml的种子液；(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比5～8％接种于发酵培养基中，在温度26～28℃、湿度30～60％、溶氧55～80mg/L的条件下发酵培养30～40h，然后加入发酵液体积1.0％～1.5％的玉米蛋白粉，继续发酵培养30～80h，制得含有卡那霉素的发酵液；所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：玉米淀粉9.00～14.00％、淀粉酶0.10～0.20％、葡萄糖0.10～1.00％、冷榨豆饼粉2.00～4.00％、豆粕粉2.00～4.00％、氯化钠0.10～0.20％、硝酸钠0.08～1.60％、硫酸锌0.02～0.06％、硫酸亚铁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.02％，余量水，pH自然。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中种子液的制备步骤如下：(i)将卡那链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的砂土孢子接种量为0.008～0.012g，在温度26～28℃、湿度30～60％的条件下培养96～168h，制得斜面孢子；(ii)将步骤(i)制得的斜面孢子按6.25～12.5cm2/L的接种量接种于种瓶培养基中，在温度26～28℃、湿度30～60％、220～240rpm的条件下培养24～40h，制得菌体浓度为107～109cfu/ml的种子液。...

【专利技术属性】
技术研发人员：展恩明，张大保，王海波，王守奎，丁新仁，
申请(专利权)人：山东齐发药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37