一种发酵生产非达霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产非达霉素的方法。在发酵生产非达霉素的过程中，通过向发酵液中添加食用油的方式，提高目标产品的产率，当发酵液溶氧由最低点开始回升时，开始间歇型或连续型添加食用油。该方法使操作简单，条件温和，原材料来源广泛，设备要求低，降低了生产成本，并且大大提高了发酵产量，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产非达霉素的方法
本专利技术涉及微生物发酵生产抗生素
，具体涉及非达霉素的发酵生产。
技术介绍
非达霉素（fidaxomicin）是由Optimer公司研发的一种新型窄谱的大环内酯类抗生素，商品名为Dificid，主要用于治疗艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)，于2011年5月27日获FDA批准上市。与目前主要的治疗药物甲硝唑与万古霉素相比，非达霉素能显著降低复发率。非达霉素结构式如下：非达霉素的制备主要由放射菌类桔橙指孢囊菌(Dactylosporangiumaurantiacum)经发酵过程产生。目前国内外关于非达霉素发酵工艺方面报道很少。CA1040564、GB1458512、US3978211中涉及发酵的部分工艺过于简化，培养基缺乏迟效碳氮源，发酵效果不佳。美国专利US20100028970中提到了发酵的相关碳氮源与微量元素，并涉及到了发酵过程中使用含葡萄糖、无机盐、氨基酸及酵母提取物的培养基，但是上述发酵方法仍然存在操作繁杂，发酵产物收率低的问题，随着全球市场对抗生素的需求不但增长，因此需要能提高非达霉素发酵单位的效果显著的改进方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对现有非达霉素发酵工艺存在的不足，基于微生物生长动力学基础，提供一种能够提高非达霉素收率的液体发酵方法，其技术方案如下：1）在种子培养基中培养营养体接种物；所述的种子培养基配制方法：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉30g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠2g/L，碳酸钙2g/L，PH7.0。配制适量的种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按种子培养基体积比0.1-0.3%的接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后27-29℃培养28-36h。2）在发酵培养基中发酵积累非达霉素；所述的发酵培养基配制方法：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，黄豆粉20g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L,碳酸钙2g/L，PH7.0。配制适量的发酵培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按发酵培养基体积比4-8%的接种量接入步骤1）种子培养基中的营养体接种物，发酵过程中控制温度在27-29℃，控制压力在0.04-0.06Mpa，控制通气在0.5-1.5VVM，控制转速在100-250rpm，溶氧电极在线监测，以确保溶氧在30%以上（假设发酵罐初始溶氧为100%）。将发酵培养持续进行，48-72h间发酵罐中溶氧量降至最低点，当发酵液溶氧由最低点开始回升时开始添加食用油，并持续发酵，发酵160h后停止添加食用油，发酵180h之后，效价不再增长时停止发酵，获得产物。所述的添加食用油选自大豆油、玉米油、菜籽油、芝麻油、橄榄油、花生油或葵花籽油，或其中几种任意的组合。所述的食用油的配制：将食用油倒入补料罐内，120℃灭菌30min，待用。所述的食用油添加，以24小时为一个时间单位，每个时间单位添加与发酵液体积比为0.5%-1.2%的食用油，添加方式为连续型或间断型。优选地，每个时间单位添加食用油的量为发酵液体积的1.0%。所述的连续型添加，控制添加量，持续不断的向发酵罐中添加食用油。所述的间断型添加，每个时间单位添加食用油2-4次。优选地，间断型添加，每8小时添加一次食用油，一个时间单位添加3次，每次添加为发酵液体积比的0.2%-0.4%的食用油，更优选的为0.3%。本专利技术中，发酵使用的菌株为桔橙指孢囊菌（Dactylosporangiumaurantiacum），该菌种可通过下述机构获得：中国农业微生物菌种保藏管理中心（AgriculturalCultureCollectionofChina），菌株保藏编号：ACCC40816。更进一步的，将上述发酵液进行分离纯化，得到高纯度的非达霉素。本专利技术的操作简单，条件温和，原材料来源广泛，设备要求低，降低了生产成本，并且大大提高了发酵产量，更适合于工业化生产。特别是申请人意外的发现，通过添加食用油的方式，不仅保证了充足的碳源，经过微生物的利用，还持续不断的补充了非达霉素生物合成途径中重要的合成前体丙酰辅酶A等物质，从而大大提高了目标产物的产量。更进一步的，申请人还发现，在发酵过程中，从发酵罐中溶氧量降至最低点并开始回升时开始添加食用油，并且以24小时为一个时间单位，每个时间单位添加与发酵液体积比为0.5%-1.2%的食用油的方式添加，保证了重要的合成前体物质的供给，满足微生物发酵的需要，大大增加培养基利用率，发酵水平显著提高，与目前工艺相比可提高发酵产量50%以上，及其适用于工业化生产。附图说明图1实施例1中添加食用油的发酵液中非达霉素检测的HPLC色谱图。图2实施例8中未添加食用油的发酵液中非达霉素检测的HPLC色谱图。图3实施例9将实施例1中发酵液分离纯化后非达霉素检测的HPLC色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不意味着对本专利技术有任何限制。将桔橙指孢囊菌（Dactylosporangiumaurantiacum）ACCC40816-80℃冰箱冻结法保存。摇瓶培养：在2.5L种子罐中配制1L的种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至27℃，接入ACCC40816菌种，在30℃，转速200rpm下摇瓶培养。实施例1发酵过程中间歇型添加食用油在500L种子罐中配制300L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至27℃，按种子培养基体积比0.1%的接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后27℃培养28h。在5000L发酵罐中配制3500L发酵培养基，120℃灭菌30min后冷却至27℃，按发酵培养基体积比4%的接种量接入上述种子培养基中营养体接种物，发酵过程中控制温度为27℃，控制压力为0.04Mpa，控制通气为0.5VVM，控制转速为100rpm，以确保溶氧在30%以上。将发酵培养持续进行，48h后发酵罐中溶氧量降至32%，并逐渐开始回升，以8小时/次，向发酵罐中添加大豆油，每次添加大豆油的用量为发酵液体积的0.2%，并持续发酵，发酵160h后停止添加大豆油，发酵180h之后，效价不再增长时停止发酵，获得产物，228nm下，超声30min，HPLC检测，色谱图如图1所示，发酵液中发酵单位为3.18g/L。实施例2发酵过程中连续型添加食用油在200L种子罐中配制100L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按种子培养基体积比0.3%的接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后29℃培养36h。在2000L发酵罐中配制1400L发酵培养基，120℃灭菌30min后冷却至29℃，按发酵培养基体积比8%的接种量接入上述种子培养基中营养体接种物，发酵过程中控制温度为29℃，控制压力为0.06Mpa，控制通气为1.5VVM，控制转速为250rpm，以确保溶氧在30%以上。将发酵培养持续进行，64h后发酵罐中溶氧量降至33%，并逐渐开始回升，以24小时为一个时间单位，64小时至88小时（第一个时间单位）之间，以48ml/min的流速持续不断的向发酵罐中添加玉米油，保持每个时间单位均添加与发酵液体积比为0.5%的玉米油，并持续发酵，发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产非达霉素的方法，其特征在于，在发酵过程中，向发酵液中添加食用油。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产非达霉素的方法，所述的发酵过程包括：1)在种子培养基中培养营养体接种物；2)在发酵培养基中接入营养体接种物，并添加食用油，持续发酵获得非达霉素，其特征在于，发酵至48-72h间发酵液中溶氧量降至最低点，当发酵液溶氧由最低点开始回升时开始添加食用油，发酵160小时后停止添加食用油，所述食用油的添加以24小时为一个时间单位，每个时间单位添加与发酵液体积比为0.5％-1.2％的食用油，添加方式为连续型，控制添加量，持续不间断的添加；或添加方式为间断型，每个时间单位添加食用油2-4次，并且发酵使用的菌株为桔橙指孢囊菌；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：别一，罗永莎，唐恒，袁建栋，
申请(专利权)人：重庆乾泰生物医药有限公司，博瑞生物医药技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85