一种纯化非达霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化非达霉素的方法。本发明专利技术所述的方法包括如下步骤：(1)将非达霉素粗品进行制备柱层析，用含有有机溶剂的酸水溶液进行洗脱，收集并合并含有非达霉素的洗脱液；和(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到非达霉素精制品。本发明专利技术的方法能够得到高纯度的非达霉素，而且收率高，环境友好，非常适合商业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化非达霉素的方法
本专利技术属于医药
，具体涉及抗生素非达霉素的纯化方法。
技术介绍
非达霉素(fidaxomicin)是近年来由Op-timer制药公司研发的一种新型窄谱的大环内酯类抗菌药。于2011年5月27日获得FDA批准在美国上市,商品名为Dificid。该药物主要用于治疗艰难梭菌(Clostridiumdifficile,又名难辨梭状芽孢杆菌)相关性腹泻(CDAD)。非达霉素的结构式如下：目前公开的非达霉素的分离纯化方法主要有：CN103275152A公开了一种高纯度非达霉素的制备方法，该方法将非达霉素发酵液过滤得到菌丝体，然后将菌丝体用极性溶剂浸泡并固液分离得到非达霉素浸提液，浸提液加水稀释后导入大孔脱色树脂处理得脱色液，脱色液导入大孔吸附树脂吸附饱和后用解析剂梯度洗脱，浓缩，萃取，干燥后得非达霉素粗品，粗品用极性溶剂溶解后注入聚合物微球柱层析，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，合并HPLC测定非达霉素含量大于95％的洗脱液，浓缩、干燥后得到HPLC含量可达97.1％的非达霉素。CN101663312A公开了一种非达霉素制备方法，该方法在发酵液培养基中加入了吸收剂树脂，在发酵完成后，从发酵液中分离固体物质(包括吸收剂树脂)，用有机溶剂如乙酸乙酯洗脱固体物质，然后减压浓缩得到非达霉素粗品。使用包含BiotageKP-C18-HS二氧化硅柱纯化，然后浓缩、结晶、干燥得到纯度78％-94.7％的非达霉素。CN102993251A公开了一种高效液相色谱纯化非达霉素的方法，该方法将纯度为78％的非达霉素粗品经过两次Uni30BPC纯化，得到纯度达到98％的非达霉素洗脱液。WO2011146621A2公开了一种非达霉素制备方法，该方法用液相制备得到纯度为93％左右的非达霉素。以上方法制备得到的非达霉素纯度都在99％以下，仍然无法满足药品生产要求，因此急需一种高纯度的非达霉素的制备方法，使其符合药品生产要求。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种环境友好，工艺简单的纯化非达霉素的方法，本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种纯化非达霉素的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将非达霉素粗品进行制备柱层析，用含有有机溶剂的酸水溶液进行洗脱，收集并合并含有非达霉素的洗脱液；和(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到非达霉素精制品。其中，步骤(1)所述的制备柱填料为C8填料，可选用华谱C8填料、纳微C8填料、艾杰尔C8填料或kromasilC8填料，优选为kromasilC8填料。其中，步骤(1)所述的有机溶剂为甲醇或乙腈；所述酸水溶液为甲酸的水溶液。优选的，步骤(1)所述的含有有机溶剂的酸水溶液为甲醇：水：甲酸＝55-75：45-25：0.1(V:V:V)，或乙腈：水：甲酸＝45-65：55-35：0.1(V:V:V)的溶液，更优选为甲醇：水：甲酸＝60-70：40-30：0.1(V:V:V)，或乙腈：水：甲酸＝50-60：50-40：0.1(V:V:V)的溶液。其中，步骤(1)中，收集并合并非达霉素HPLC纯度≥99.5％的洗脱液。其中，步骤(1)所述非达霉素粗品是由以下方法制备得到的：(a)将含有非达霉素的发酵液进行预处理，得到含有非达霉素的溶液；(b)将步骤(a)所得非达霉素的溶液进行纳滤浓缩，得到含有非达霉素的浓缩液；(c)从步骤(b)所得浓缩液中分离得到非达霉素粗品。其中，步骤(a)所述的预处理包括以下步骤：将含有非达霉素的发酵液进行固液分离得到菌丝体，接着将菌丝体用有机溶剂浸泡，优选的，所述有机溶剂为甲醇或者乙醇，更优选为乙醇，然后过滤得到含有非达霉素的溶液。其中，步骤(b)所述的纳滤浓缩使用的纳滤膜为DK或DL纳滤膜，优选为DL纳滤膜。优选的，经过纳滤浓缩后得到的浓缩液中非达霉素的单位≥10000mg/L。其中，可采用本领域公知的方法从步骤(b)所得浓缩液中分离得到非达霉素粗品。在一个具体的实施例中，可以加入一种反溶剂，优选水，纳滤膜浓缩液加水后使得浓缩液中有机溶剂的体积浓度小于35％，优选25％-30％。其中，可采用本领域公知的方法从步骤(1)所得洗脱液中分离得到非达霉素精制品。在一个具体的实施例中，可以加入一种反溶剂，优选水，水的加入量与步骤(1)收集到的洗脱液的体积比为1-2:1，优选1.4-1.6:1。本专利技术的优势在于：本专利技术在非达霉素粗品的制备过程中，将含有非达霉素的发酵预处理液采用纳滤膜浓缩，可以去除发酵液中大部分无机盐和色素类物质；最后选用C8填料的制备柱，使得杂质和非达霉素得到有效分离，最后得到的非达霉素HPLC纯度≥99.5％，收率≥50％。另外，本专利技术所用有机溶剂可回收重复使用，三废排放少，环境友好，非常符合当今医药生产趋势和要求。附图说明图1实施例1中的非达霉素发酵液HPLC图谱图2实施例1制备得到的非达霉素粗品沉淀物HPLC图谱图3实施例1制备得到的非达霉素精制品HPLC图谱具体实施例本专利技术发酵培养所用游动放线菌已于2013年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.7294。纳滤膜，通用电气公司(GE)；制备柱，北京创新通恒科技有限公司；C8填料，华谱新创科技有限公司、阿克苏诺贝尔公司；高效液相色谱仪，岛津LC2010HT；非达霉素菌丝体中加入的乙醇、甲醇为市售工业级；制备用甲醇、乙腈为市售色谱级；甲酸为市售试剂级。本专利技术发酵液培养过程如下：(1)平板菌落的制备与培养平板采用ISP2培养基(g/L)：葡萄糖4，酵母抽提物4，麦芽抽提物10，琼脂15，蒸馏水1000mL，pH7.3，灭菌压力1.05kg/cm2，20min，冷却到50-60℃倒平板，接入游动放线菌(CGMCCNO.7294)菌体，经28±1℃培养8天后，菌丝成熟。(2)摇瓶种子液的制备与培养种子培养基配方(g/L)：蔗糖2，山梨醇3，棉籽饼粉3，花生饼粉1.5，CaCO30.6，MgSO4·7H2O0.3，pH7.2，摇瓶装液量为25mL/250mL，经121℃灭菌30分钟。菌体接种量为105-106c.f.u./mL,培养温度28±1℃，250rpm，摇床振荡培养28小时，此时培养液pH6.8-7.0，菌丝浓度25-30％(体积百分比)。(3)种子罐种子液的制备在15L种子罐中投入10L的种子培养基(培养基配方(g/L)：蔗糖10，山梨醇2，可溶性淀粉3，(NH4)2SO40.5，牛肉膏2，花生饼粉1，KH2PO40.04，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入100mL摇瓶种子液，培养温度为28±1℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm，培养24小时，此时培养液pH6.8-7.0，菌丝浓度25-30％(v/v)。(4)发酵罐培养基的配制与培养发酵培养基配方(g/L)：蔗糖10，山梨醇2，可溶性淀粉3，(NH4)2SO40.5，牛肉膏2，花生饼粉1，KH2PO40.04，添加1％PPG作为消泡剂，投料体积为35L，pH7.0，于121℃条件下蒸汽灭菌20分钟，冷却后，接入约3.5L种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌转速200-300rpm，通气量0.8-1.0vvm，发酵培养8天。实施例1：将30L非本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化非达霉素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将非达霉素粗品进行制备柱层析，用含有有机溶剂的酸水溶液进行洗脱，收集并合并含有非达霉素的洗脱液；和(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到非达霉素精制品。

【技术特征摘要】
1.一种纯化非达霉素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将非达霉素粗品进行制备柱层析，用含有有机溶剂的酸水溶液进行洗脱，收集并合并含有非达霉素的洗脱液；和(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到非达霉素精制品；其中，步骤(1)所述非达霉素粗品是由以下方法制备得到的：(a)将含有非达霉素的发酵液进行预处理，得到含有非达霉素的溶液；(b)将步骤(a)所得非达霉素的溶液进行纳滤浓缩，得到含有非达霉素的浓缩液；(c)从步骤(b)所得浓缩液中分离得到非达霉素粗品；其中，步骤(1)所述的制备柱填料为C8填料。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述预处理包括以下步骤：将含有非达霉素的发酵液进行固液分离得到菌丝体，接着将菌丝体用有机溶剂浸泡，然后过滤得到含有非达霉素的溶液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述有机溶剂为甲醇或者乙醇。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述有机溶剂为乙醇。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：任会军，李道超，应雪肖，陈峰，郑玲辉，王玲萍，白骅，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33