【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及胞磷胆碱的生产。
技术介绍
1、胞磷胆碱，又称胞二磷胆碱，简称cdpc，为核苷衍生物，是脑代谢激活剂，可改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复。对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用，临床应用较广。所以，胞磷胆碱的合成技术是人们比较关心的研究课题。
2、与胞苷以及cmp可以廉价的制造和供应相比，虽然报道的胞磷胆碱的合成方法有化学合成法、酶法以及微生物转化法等，但是胞磷胆碱的制造成本仍旧较高。化学方法主要见于早期工业路线，但是此法使用多种工业有毒有机试剂，转化率低，不适于大规模的生产。目前工业上利用啤酒泥通过添加cmp和磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱(酶转化法)，但是底物价格较为昂贵，难以提高生产效率。目前常用的方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成，但由于工艺原因，转化率普遍较低、发酵周期较长，产品浓度较低。例如，日本协和发酵株式会社开发的双菌发酵法，利用大肠杆菌和产氨棒杆菌等基因工程菌发酵生产胞磷胆碱，但是发酵工艺较为复杂。
3、由于胞磷胆碱的广泛应用，其市场需求量正逐步扩大，有着极大的需求缺口。如何高效率、高质量、低成本的生产胞磷胆碱是急需解决的问题。因此，本领域还需要进一步地研究和开发胞磷胆碱的其它生产方法，以期简化生产工艺，降低生产成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供利用氯化胆碱和胞苷作为底物生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用，已解决现有技术的问题。>
2、在第一个方面，提供一种能够生产胞磷胆碱的工程菌的构建方法，所述构建方法以酵母菌为出发菌，转入编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)、胆碱激酶(cki)和胞苷激酶(udk)的基因。
3、在优选的实施方式中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)的氨基酸序列如seq idno:26所示，所述胆碱激酶(cki)的氨基酸序列如seq id no:27所示，所述胞苷激酶(udk)的氨基酸序列如seq id no:28所示。
4、在进一步优选的实施方式中，编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)的基因来源于具核梭杆菌，编码胆碱激酶(cki)的基因来源于酿酒酵母by4741，编码胞苷激酶(udk)的基因来源于嗜热栖热菌。
5、在进一步优选的实施方式中，编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，或其简并序列，或与seq id no:1具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)；
6、编码胆碱激酶(cki)的基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，或其简并序列，或与seq id no:2具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码胆碱激酶(cki)；
7、编码胞苷激酶(udk)的基因的核苷酸序列如seq id no:3所示，或其简并序列，或与seq id no:3具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码胞苷激酶(udk)。
8、在优选的实施方式中，所述方法进一步包括敲除出发酵母菌中的编码胞苷脱氨酶(cdd1)、胆碱磷酸转移酶(cpt1)和任性地尿苷核苷酶(urh1)的基因。
9、在优选的实施方式中，所述胞苷脱氨酶(cdd1)的氨基酸序列如seq id no:32所示，所述胆碱磷酸转移酶(cpt1)的氨基酸序列如seq id no:34所示，所述尿苷核苷酶(urh1)的氨基酸序列如seq id no:36所示。
10、在进一步优选的实施方式中，编码胞苷脱氨酶(cdd1)的基因的核苷酸序列如seqid no:33所示，或其简并序列，或与seq id no:33具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码胞苷脱氨酶(cdd1)；
11、编码胆碱磷酸转移酶(cpt1)的基因的核苷酸序列如seq id no:35所示，或其简并序列，或与seq id no:35具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码胆碱磷酸转移酶(cpt1)；
12、编码尿苷核苷酶(urh1)的基因的核苷酸序列如seq id no:37所示，或其简并序列，或与seq id no:37具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码尿苷核苷酶(urh1)。
13、在优选的实施方式中，所述酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母等。
14、在进一步优选的实施方式中，所述酵母菌为酿酒酵母cen.pk2-1c，所述酵母的基因型为：mata；ura3-52,trp1-289,leu2-3,112,his3δ1；mal2-8c；suc2，该酵母有以下四种氨基酸缺陷，ura、trp、leu以及his。在优选的实施方式中，所述方法进一步包括补全尿嘧啶、组氨酸、色氨酸以及亮氨酸缺陷。补全尿嘧啶、组氨酸、色氨酸以及亮氨酸缺陷的方式是本领域公知的，如，转入编码合成尿嘧啶、组氨酸、色氨酸以及亮氨酸的基因。
15、在优选的实施方式中，所述方法包括，以酿酒酵母cen.pk2-1c为出发菌，以crispr/cas9基因编辑技术敲除编码cdd1、cpt1和任选地urh1的基因，转入编码cct、cki和udk的基因，补全尿嘧啶、组氨酸、色氨酸以及亮氨酸缺陷。
16、在一种优选的实施方式中，所述方法包括，以酿酒酵母cen.pk2-1c为出发菌，以crispr/cas9基因编辑技术，敲除cdd1基因的同时引入一个拷贝的udk基因，敲除cpt1基因的同时引入了各一个拷贝的cct和cki基因，在基因组的h1位点处引入各一个拷贝的cct和cki基因，在h2位点引入一个拷贝的udk基因。
17、在一种具体实施方式中，所述方法包括，以酿酒酵母cen.pk2-1c为出发菌，以crispr/cas9基因编辑技术，敲除cdd1基因的同时引入一个拷贝的udk基因，敲除cpt1基因的同时引入了各一个拷贝的cct和cki基因，敲除urh1基因的同时引入一个拷贝的leu2基因，在基因组的h1位点处引入各一个拷贝的cct和cki基因，在h2位点引入一个拷贝的udk基因。
18、在一种具体实施方式中，所述方法包括，以酿酒酵母cen.pk2-1c为出发菌，以crispr/cas9基因编辑技术，敲除cdd1基因的同时引入一个拷贝的udk基因，敲除cpt1基因的同时引入了各一个拷贝的cct和cki基因，敲除urh1基因的同时引入leu2基因，在基因组的h1位点处引入各一个拷贝的cct和cki基因，在h2位点引入一个拷贝的udk基因，补全尿嘧啶、组氨酸、色氨酸以及亮氨酸缺陷。
19、在一种具体实施方式中，所述方法包括，以酿酒酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够生产胞磷胆碱的工程菌的构建方法，所述构建方法以酵母菌为出发菌，转入编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)、胆碱激酶(CKI)和胞苷激酶(udk)的基因；敲除出发酵母菌中的编码胞苷脱氨酶(CDD1)、胆碱磷酸转移酶(CPT1)和任选地尿苷核苷酶(URH1)的基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述胆碱激酶(CKI)的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述胞苷激酶(udk)的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述胞苷脱氨酶(CDD1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述胆碱磷酸转移酶(CPT1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述尿苷核苷酶(URH1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其中，所述编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其中，所述酵母菌为酿酒酵母或毕赤酵母；优选地，所述酵母菌为酿酒酵母CEN.PK2-1C；进一步优选地，所述方法还包括补全尿嘧啶、组氨酸、色氨酸以及亮氨酸缺陷。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述方法包括，以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌，以crispr/Cas9基因编辑技术，敲除CDD1基因的同时引入一个拷贝的udk基因，敲除CPT1基因的同时引入了各一个拷贝的CCT和CKI基因，在基因组的H1位点处引入各一个拷贝的CCT和CKI基因，在H2位点引入一个拷贝的udk基因；或者
6.根据权利要求1～5任一项所述的构建方法，其中，所述转入基因为转入基因本身或以表达盒的形式转入基因；优选地，所述表达盒包括启动子、待转入基因和终止子；进一步优选地，所述启动子为TEF启动子、GAP启动子；所述终止子为CYC1终止子。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其中，利用载体携带基因或表达盒转入基因；优选地，所述载体为pRS306。
8.一种能够生产胞磷胆碱的工程菌，由权利要求1～7任一项所述的构建方法构建；
9.一种生产胞磷胆碱的方法，所述方法包括：培养权利要求8所述的工程菌，以氯化胆碱和胞苷作为底物，生产胞磷胆碱；
10.一种用于生产胞磷胆碱的组合物或试剂盒，所述的组合物或试剂盒中包含权利要求8所述的工程菌。
...【技术特征摘要】
1.一种能够生产胞磷胆碱的工程菌的构建方法，所述构建方法以酵母菌为出发菌，转入编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)、胆碱激酶(cki)和胞苷激酶(udk)的基因；敲除出发酵母菌中的编码胞苷脱氨酶(cdd1)、胆碱磷酸转移酶(cpt1)和任选地尿苷核苷酶(urh1)的基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)的氨基酸序列如seq id no:26所示，所述胆碱激酶(cki)的氨基酸序列如seq id no:27所示，所述胞苷激酶(udk)的氨基酸序列如seq id no:28所示，所述胞苷脱氨酶(cdd1)的氨基酸序列如seq id no:32所示，所述胆碱磷酸转移酶(cpt1)的氨基酸序列如seq id no:34所示，所述尿苷核苷酶(urh1)的氨基酸序列如seq id no:36所示。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其中，所述编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，或其简并序列，或与seq id no:1具有至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的序列一致性且编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)；
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其中，所述酵母菌为酿酒酵母或毕赤酵母；优选...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵侃凯，许海霞，郭安芳，孙鹏，杨小虎，杨志良，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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