【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物限度检查领域，具体而言，涉及一种用于莫匹罗星原料药微生物限度检查的抗菌活性去除方法。
技术介绍
1、莫匹罗星(mupirocin，mpc，式i)是一种由荧光假单胞菌发酵产生的广谱抗生素，在结构上较为特殊，与其他抗生素无关联；其抗菌作用主要是通过可逆性地与异亮氨酸转移rna合成酶结合，阻止异亮氨酸渗入，中止细胞内含异亮氨酸的蛋白质合成而起到杀菌或抑菌的作用。莫匹罗星在很低浓度时显示抑菌作用，在高浓度时起杀菌作用。对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及化脓性链球菌等革兰阳性球菌具较强的抗菌活性；对一部分革兰阴性菌有一定抗菌活性，对厌氧菌、真菌无抗菌作用。
2、
3、微生物限度检查是检查非无菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括微生物计数(需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数)及控制菌检查。
4、莫匹罗星是目前应用广泛的一种皮肤表面抗菌制剂。现有技术中，如莫匹罗星软膏微生物限度检查方法适用性研究及水分活度测定(李翠等，2022)、莫匹罗星软膏微生物限度检查方法的建立(张红霞等，2017)和莫匹罗星软膏微生物限度检查的方法学验证(杨育林等，2014)，均只有关于莫匹罗星软膏剂的微生物限度检测方法，而对抗菌性更强的莫匹罗星原料药(莫匹罗星原料药微生物限度检测时，取样量大，抗菌活性去除难度大)的微生物限度检测尚未有详细报道。随着新版药典法规的升级，其他非规定灭菌制剂及其原辅料在生产、储存、销售过程中都要进行一定限度的微生物检查，同时规定不得有控制菌的存在。同时，采用中国药典及其他
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种莫匹罗星原料药微生物限度检查的抗菌活性去除方法，通过选用特定的稀释液和冲洗液，有效消除了残余莫匹罗星原料药的抑菌性，能够实现莫匹罗星原料药微生物限度的准确检测。
2、为实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
3、(1)将微生物限度各检测项的供试液分散至稀释液b中，得到对应的待过滤液，优选地，所述稀释液b为含有吐温80和聚乙二醇400的蛋白胨水溶液，进一步优选地，所述稀释液b为含有吐温80和聚乙二醇400的0.1％蛋白胨水溶液；
4、(2)将步骤(1)所得待过滤液进行过滤，然后用冲洗液对滤膜进行冲洗，最后一次的冲洗液中加入试验菌，优选的，所述冲洗液为含有吐温80和聚乙二醇400的蛋白胨水溶液，进一步优选地，所述稀释液b为含有吐温80和聚乙二醇400的0.1％蛋白胨水溶液；
5、(3)冲洗过后，将滤膜转移至培养基中进行培养。
6、在优选的实施方案中，所述稀释液b中，吐温80的浓度为0.5％～1.5％g/ml，优选1％～1.5％g/ml；聚乙二醇400的浓度为20％～40％g/ml，优选30％～40％g/ml。
7、在优选的实施方案中，所述冲洗液中，吐温80的浓度为0.5％～1.5％g/ml，优选1％～1.5％g/ml；聚乙二醇400的浓度为20％～40％g/ml，优选30％～40％g/ml。
8、在优选的实施方案中，所述步骤(1)中不同微生物限度各检测项的供试液的制备方法为：将莫匹罗星原料药分散于稀释液a中，得到1:10g/ml样品溶液，取1:10g/ml样品溶液上清液，以稀释液a继续稀释至1:100，得到1:100g/ml样品溶液，其中，取1:10g/ml样品溶液上清液作为控制菌检查以及霉菌和酵母菌总数检查的供试液：取1:100g/ml样品溶液为需氧菌总数检查的供试液；优选地，所述稀释液a为ph7.0氯化钠蛋白胨缓冲液。
9、在优选的实施方案中，所述步骤(1)中的供试液与稀释液b的体积比为1:20～100，优选地，控制菌检查供试液与稀释液b的体积比为1:20～50，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查供试液与稀释液b的体积比为1:50～100。
10、在优选的实施方案中，所述步骤(2)过滤为分膜过滤或单膜过滤，每膜的过滤量为100ml～250ml，优选为100ml。
11、在优选的实施方案中，所述步骤(2)过滤中每膜平均所过滤供试液的量为≤5ml；其中，控制菌检查优选每膜平均所过滤供试液的量为5ml；需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查优选每膜平均所过滤供试液的量为1ml。以控制菌检查分两膜过滤为例，此步骤中，优选为以10ml供试液和200ml稀释液b混合所得稀释液为待过滤液，每膜平均所过滤供试液的量为5ml。采用如上的浓度条件和取样量，将待测原料分散稀释后再进行过滤，能够进一步降低待测莫匹罗星原料药的抑菌性。
12、在优选的实施方案中，所述步骤(2)冲洗的冲洗量为300ml～1000ml/膜；优选为500ml/膜。
13、在优选的实施方案中，所述步骤(3)中，控制菌检查时，所述培养基为胰酪大豆胨液体培养基；需氧菌总数检查时，所述培养基为胰酪大豆胨固体培养基；霉菌和酵母菌总数检查时，所述培养基为沙氏葡萄糖固体培养基。
14、在优选的实施方案中，所述胰酪大豆胨液体培养基体积为200ml～500ml；优选为500ml。
15、根据抗菌谱特点，莫匹罗星对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌高度敏感，最低抑菌浓度mic为0.125～0.25ug/ml，对革兰阴性菌也有一定抗菌活性，而对厌氧菌、真菌无抗菌作用。因此本专利技术首先对取样量最大、抗菌活性去除难度最大的控制菌金黄色葡萄球菌检测进行方法研究，再将方法应用在控制菌铜绿假单胞菌、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数进行检测方法验证。
16、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
17、1、现有技术中仅公布了莫匹罗星软膏剂的微生物限度检查方法，但对于难度较大的莫匹罗星原料药微生物限度检查尚无报道，本专利技术填补了该领域的空白。
18、2、采用本专利技术技术方案，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数中所有试验菌的回收率均达到70～200％(药典标准50～200％)，控制菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均能检出，说明本专利技术的技术方案能够有效消除检查过程中残留莫匹罗星原料药的抑菌性，避免了假阴性、漏检等问题，保证了莫匹罗星原料药微生物限度检查测定结果的准确性，符合新版药典法规的要求。
19、3、本专利技术突破常规，选用特定的稀释液和冲洗液(在0.1％蛋白胨水溶液的基础上，添加特定浓度的吐温80和聚乙二醇400)，大大降低了滤膜冲洗过程中的冲洗难度，并减少了分膜数，实现需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数单膜过滤，控制菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分2膜过滤，操作简便，日常验证和检测时间缩短，大大降低了检测成本。
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1.一种用于莫匹罗星原料药微生物限度检查的抗菌活性去除方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液B中，吐温80的浓度为0.5％～1.5％g/mL，优选1％～1.5％g/mL；聚乙二醇400的浓度为20％～40％g/mL，优选30％～40％g/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述冲洗液中，吐温80的浓度为0.5％～1.5％g/mL，优选1％～1.5％g/mL；聚乙二醇400的浓度为20％～40％g/mL，优选30％～40％g/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤为分膜过滤或单膜过滤，每膜的过滤量为100mL～250mL，优选为100mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤中每膜平均所过滤供试液的量为≤5mL；其中，控制菌检查优选每膜平均所过滤供试液的量为5mL；需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查优选每膜平均所过滤供试液的量为1mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中微生物限度各检测项的供试液的制备方法为：将莫匹罗星原料药分散于稀释液A中，得到1:10g/mL样品溶液，取1:10g/mL样品溶液上清液，以稀释液A继续稀释至1:100，得到1:100g/mL样品溶液，其中，取1:10g/mL样品溶液上清液作为控制菌检查以及霉菌和酵母菌总数检查的供试液，取1:100g/mL样品溶液作为需氧菌总数检查的供试液；优选地，所述稀释液A为pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的供试液与稀释液B的体积比为1:20～100，优选地，控制菌检查供试液与稀释液B的体积比为1:20～50，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查供试液与稀释液B的体积比为1：50～100。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，控制菌检查时，所述培养基为胰酪大豆胨液体培养基；需氧菌总数检查时，所述培养基为胰酪大豆胨固体培养基；霉菌和酵母菌总数检查时，所述培养基为沙氏葡萄糖固体培养基。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述胰酪大豆胨液体培养基体积为200mL～500mL；优选为500mL。
...【技术特征摘要】
1.一种用于莫匹罗星原料药微生物限度检查的抗菌活性去除方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液b中，吐温80的浓度为0.5％～1.5％g/ml，优选1％～1.5％g/ml；聚乙二醇400的浓度为20％～40％g/ml，优选30％～40％g/ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述冲洗液中，吐温80的浓度为0.5％～1.5％g/ml，优选1％～1.5％g/ml；聚乙二醇400的浓度为20％～40％g/ml，优选30％～40％g/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤为分膜过滤或单膜过滤，每膜的过滤量为100ml～250ml，优选为100ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤中每膜平均所过滤供试液的量为≤5ml；其中，控制菌检查优选每膜平均所过滤供试液的量为5ml；需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查优选每膜平均所过滤供试液的量为1ml。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)冲洗的冲洗量为300ml～1000ml/膜；优选为500ml/膜。
7.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：方佳双，潘玲玲，项仁鑫，徐倩，杨小虎，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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