【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病理生理学领域，特别涉及一种成年小鼠海马脑片的体外培养方法。
技术介绍
1、小鼠脑片的体外培养方法，用小鼠海马组织切片，在脑片培养基中进行培养得到。该培养方法周期短、操作简单、可行性高，适于商业化。对神经系统许多功能的研究，最理想的条件是保持在体固有的、立体的神经、胶质细胞之间动态联系的基础上进行，这种在体细胞间固有的完整联系通过原代神经细胞培养是不能实现的。但是，在体研究最大的困难在于实验受制因素太多，不便控制实验条件和观察实验结果。体外培养的脑片包含了与在体脑组织相同的细胞种类及细胞的三维空间结构，保存了正常完整的突触回路、受体分布、递质传递和其他生理功能。脑片的体外长期培养为研究药物和毒素对中枢神经的慢性作用、神经损伤与修复、神经发育等提供了理想的条件。由于体外培养脑片突出的优越性，脑片培养技术是神经科学研究中不可或缺的重要实验手段。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种成年小鼠海马脑片的体外培养方法，该方法探索利用所培养的脑片组织进行免疫荧光染色检测的可行性。
2、本专利技术提供了一种成年小鼠海马脑片的体外培养方法，包括：
3、（1）配制成年小鼠海马脑片培养krebs缓冲液和成年小鼠海马脑片培养基；
4、（2）将剥离的3-12月龄成年小鼠大脑浸泡在预冷却的krebs缓冲液中，洗去多余血液、毛发，然后转移至新鲜krebs缓冲液中；
5、（3）快速取出小鼠完整海马大脑组织，使用切片机将组织切成脑片，将制
6、所述步骤（1）中的krebs缓冲液的组成为：nacl 8.5-8.9 g/l，kcl 0.4-0.6 g/l，nah2po4 0.1-0.2g/l，mgcl2 0.2-0.4 g/l，cacl2 0.5-0.8 g/l，glucose 0.1-0.2 g/l，nahco3 0.3-0.5 g/l；使用超纯水配置成1000ml, 调节ph至7-8，滤膜过滤后使用。
7、所述步骤（1）中的脑片培养基的组成为：neurobasal-a、l-glutamate、青链霉素双抗和1-20%的马血清。
8、成年小鼠海马脑片培养试剂配制需要进行高温灭菌或0.22μm的滤膜进行过滤除菌，避免脑片和培养基污染。
9、所述步骤（3）中的脑片厚度为350 μm，有助于长期稳定培养海马组织切片，显著提高脑片组织的存活率。
10、所述步骤（3）中的培养皿中的脑片数目为3-5片。
11、所述步骤（3）中的细胞培养箱为37℃、5% co2细胞培养箱。
12、所述小鼠海马大脑切片制备时，全程在冰上操作，降低神经元活性，减少炎症因子释放，减轻神经元损伤。
13、所述成年小鼠海马脑片连续培养，在脑片培养基中加入提前超声处理的α-突触核蛋白预制蛋白纤维（α-synuclein pffs），在成年小鼠海马脑片上诱导帕金森病模型。
14、所述加入α-突触核蛋白处理一星期后，使用免疫荧光染色技术，检测成年海马脑片上神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的存活情况；同时检测不同类型细胞亚群对于外源性加入α-synuclein pffs的内吞及其对于神经元的损伤情况。
15、有益效果
16、本专利技术培养方法操作简便、时间周期短，利用该方法培养出来的成年小鼠海马脑片为研究药物和毒素对中枢神经的慢性作用、神经损伤与修复、神经发育等提供了理想的条件。
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1.一种成年小鼠海马脑片的体外培养方法，包括：
2. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中的Krebs缓冲液的组成为：NaCl 8.5-8.9 g/L，KCl 0.4-0.6 g/L，NaH2PO4 0.1-0.2g/L，MgCl2 0.2-0.4 g/L，CaCl2 0.5-0.8 g/L，glucose 0.1-0.2 g/L，NaHCO3 0.3-0.5 g/L；使用超纯水配置成1000 mL, 调节pH至7-8，滤膜过滤后使用。
3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中的脑片培养基的组成为：Neurobasal-A、L-glutamate、青链霉素双抗和1-20%的马血清。
4. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中的脑片厚度为350 μm。
5.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中的培养皿中的脑片数目为3-5片。
6. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中的细胞培养箱为37℃、5%
7.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述成年小鼠海马脑片连续培养，在脑片培养基中加入提前超声处理的α-突触核蛋白预制蛋白纤维，在成年小鼠海马脑片上诱导帕金森病模型。
8. 根据权利要求7所述的体外培养方法，其特征在于：所述加入α-突触核蛋白处理一星期后，使用免疫荧光染色技术，检测成年海马脑片上神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的存活情况；同时检测不同类型细胞亚群对于外源性加入α-synuclein PFFs的内吞及其对于神经元的损伤情况。
...【技术特征摘要】
1.一种成年小鼠海马脑片的体外培养方法，包括：
2. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中的krebs缓冲液的组成为：nacl 8.5-8.9 g/l，kcl 0.4-0.6 g/l，nah2po4 0.1-0.2g/l，mgcl2 0.2-0.4 g/l，cacl2 0.5-0.8 g/l，glucose 0.1-0.2 g/l，nahco3 0.3-0.5 g/l；使用超纯水配置成1000 ml, 调节ph至7-8，滤膜过滤后使用。
3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中的脑片培养基的组成为：neurobasal-a、l-glutamate、青链霉素双抗和1-20%的马血清。
4. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴齐辉，刘宇，周林林，王宇炜，艾璞，李成杰，刘倚含，
申请(专利权)人：上海市第四人民医院，
类型：发明
国别省市：
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