一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集；S2、裂解细胞并收集裂解液；S3、裂解液进行连续的阴‑阳离子交换层析。本发明专利技术的纯化方法操作简便、生产快速、产品纯度高、蛋白构象正确，其具有工艺周期短、收率高、易于线性放大至生产规模的特点。纯化出的HA蛋白具有较高的回收率，纯度大于95％，并且保留了HA蛋白的生物学活性。

Purification method of hemagglutinin protein of influenza virus

The invention relates to a purification method of influenza virus hemagglutinin, which comprises the following steps: the expression of S1, protein and cell collection; S2, cell lysis and collection of lysates; S3, lysates were negative cation exchange chromatography continuous. The purification method of the invention has the advantages of simple operation, rapid production, high product purity and correct conformation of protein. The purification method has the characteristics of short process cycle, high yield and easy linear amplification to the production scale. The purified HA protein has a high recovery rate, purity of more than 95%, and retains the biological activity of HA protein.

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法。
技术介绍
流感病毒(Influenzavirus,IV)可以在禽类、哺乳动物和人类中引起流行性感冒。流感病毒属于正黏病毒科，病毒根据M和NP蛋白的不同分为甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型和丁(D)型流感病毒。甲型流感病毒根据血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为不同的亚型。目前已知的有18种不同HA亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)。甲型流感病毒的研究具有非常重要的公共卫生意义。人的季节性流感主要由甲型H1N1、H3N2亚型流感病毒和乙型流感病毒引起，每年在全球会造成25～50万人的死亡。20世纪以来，甲型流感病毒引发了几次人类流感大流行。第一次也是最具灾难性的一次是发生于1918～1919年的西班牙流感，共导致全球约5000万人死亡。第二次和第三次流感大暴发分别为1957年的亚洲流感和1968年的香港流感。2009年，墨西哥流感迅速蔓延至全球200余个国家和地区，截至2012年造成了全球57.9万人的死亡。2013年以来，我国高致死率的H7N9流感病毒暴发也引发了全球的关注。甲型流感病毒也能够感染其他哺乳动物和禽类，因此根据宿主的不同又可将流感病毒分为猪流感病毒、禽流感病毒等。禽流感是严重威胁养禽业的烈性传染病。其中H5和H7亚型的禽流感病毒为高致病性禽流感病毒，表现为发病迅速、临床症状严重和死亡率高；H9N2亚型禽流感病毒主要为低致病性禽流感病毒，致病特点为致病力低、潜伏周期长，症状缓和、致死率低，但是其传染性强、传播范围广。猪流感病毒可以引起猪呼吸道疾病，同时也是一种免疫抑制性疾病，导致猪并发或者继发其他病毒性细菌性疾病。因此，流感病毒不仅影响了人类的生命健康，同时严重影响畜禽养殖业的持续稳定发展。流感病毒疫苗的研发和抗体检测是流感病毒预防和诊断的关键，具有非常重要意义。流感病毒疫苗的研制和诊断方法的开发通常针对血凝素蛋白。流感病毒囊膜表面的血凝素蛋白(HA)与流感病毒的感染性、致病性、增殖能力等生物学特性息息相关。HA蛋白是流感病毒中最重要的抗原蛋白和免疫原性蛋白，能刺激机体产生相应的体液免疫和细胞免疫，从而使机体能抵抗相应的病毒。HA蛋白属于I型跨膜糖蛋白，大约由562～566个氨基酸组成。HA蛋白在天然状态下以同源三聚体形式存在，每一单体可以分为HA1和HA2，以二硫键相连。受到感染的宿主细胞首先产生全长、未裂解的、糖基化修饰的HA蛋白前体，然后被裂解为HA1和HA2。针对全长HA蛋白进行疫苗的研发十分普遍。因此表达和纯化具有高纯度、正确构象和功能活性的全长HA蛋白十分重要。目前国内外主要HA蛋白的表达方式为原核表达或者真核表达，而纯化方式为镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化。原核表达的蛋白具有表达量大的优点，但是也具有很多缺点，比如：表达的蛋白不具有天然构象、内毒素难以完全去除等缺点。真核表达方法表达HA蛋白能够克服上述缺点，而其中昆虫细胞杆状病毒表达系统又具备表达量高、适合大规模生产的优点，因此备受青睐。镍柱亲和层析纯化方法中需要在HA蛋白中加入一段外源的6个组氨酸的肽段，可能会在HA蛋白亚单位疫苗的应用中带来意料之外的副作用，另外亲和柱的价格较为昂贵，因此亲和层析纯化方法的应用具有一定的局限性。而离子交换层析纯化方法是一种应用广泛并且适合大规模生产的一种纯化方法，但现存的问题是纯化的步骤较多、耗时较长、目的蛋白损失较多。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集；S2、裂解细胞并收集裂解液；S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。优选地，步骤S1包括如下具体步骤：通过Bac-to-Bac系统构建包含血凝素基因全长片段的重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后离心收集沉淀。优选地，步骤S1中构建重组杆状病毒的方法为：利用RT-PCR技术扩增流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段；将血凝素基因全长片段插入pFastBac系列载体中，并用热激法转化含有杆状病毒基因组的感受态细胞，使血凝素基因全长片段通过同源重组插入杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒基因组(rBacmid)；将rBacmid转染昆虫细胞，培养后离心收集上清即为重组杆状病毒(rBV)种毒。优选地，步骤S2具体包括如下步骤：用裂解缓冲液以8毫升每克悬浮细胞沉淀，200rpm搅拌30min，将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mMEDTA二钠，2％TritonX-100，5％甘油，pH5.9。优选地，步骤S3具体包括如下步骤：S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱进行再生后，将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱按顺序连接起来；S32、裂解液上柱：将包含HA蛋白的裂解液以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，上样体积不超过10个柱体积；S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，之后将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱分离；S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过阳离子交换层析柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白；所述平衡缓冲液A的配方为：20mM磷酸三钠，1.0mMEDTA二钠，0.01％TritonX-100，5％甘油，pH5.9；所述平衡缓冲液B的配方为：20mM磷酸三钠，0.05％TritonX-100，5％甘油，pH7.03；所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，10～100mMNaCl，0.05％TritonX-100，5％甘油，pH7.03。优选地，步骤S33还包含用5倍柱体积平衡缓冲液B以1～2ml/min流速过分离后阳离子交换层析柱的步骤。优选地，阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱的再生方法为：首先用5倍柱体积再生缓冲液洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；其次用5倍柱体积灭菌的去离子水洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；最后用5倍柱体积平衡缓冲液A平衡层析柱，流速控制为5ml/min；所述再生缓冲液配方为：0.5MNaOH，1MNaCl。优选地，所述纯化方法还包含S4浓缩步骤，将纯化的血凝素蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释，稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜，浓缩10～100倍，重复一次，浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。优选地，所述阴离子交换层析柱为Macro-PrepQ，所述阳离子交换层析柱为Macro-PrepHighS。优选地，所述流感病毒包含但不限于甲型或乙型流感病毒。优选地，所述甲型流感病毒包含但不限于H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9亚型流感病毒。本专利技术流感病毒血凝素蛋白(下文中简写为HA蛋白)的纯化方法，收集表达HA蛋白的细胞，裂解细胞收集裂解液，裂解液经阴-阳离子交换层析柱纯化，杂蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集；S2、裂解细胞并收集裂解液；S3、裂解液进行连续的阴‑阳离子交换层析。

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集；S2、裂解细胞并收集裂解液；S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤S1包括如下具体步骤：通过Bac-to-Bac系统构建包含血凝素基因全长片段的重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后离心收集沉淀。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤S1中构建重组杆状病毒的方法为：利用RT-PCR技术扩增流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段；将血凝素基因全长片段插入pFastBac系列载体中，并用热激法转化含有杆状病毒基因组的感受态细胞，使血凝素基因全长片段通过同源重组插入杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒基因组rBacmid；将rBacmid转染昆虫细胞，培养后离心收集上清即为重组杆状病毒种毒。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤S2具体包括如下步骤：用裂解缓冲液以8毫升每克悬浮细胞沉淀，200rpm搅拌30min，将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mMEDTA二钠，2％TritonX-100，5％甘油，pH5.9。5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤S3具体包括如下步骤：S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱进行再生后，将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱按顺序连接起来；S32、裂解液上柱：将裂解液以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，上样体积不超过10个柱体积；S33、柱平衡：将5倍柱体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永长，王洋，薛春宜，刘大才，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44