H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用。本发明专利技术以H5亚型AIV的HA氨基酸序列作为模板，在固相载体上原位合成抗原表位多肽，每条多肽含有15个氨基酸，并且后一条多肽与前一条重叠14个氨基酸。将合成的H5 AIV HA抗原表位与已知H5亚型阳性血清反应，通过肽扫描技术，最终筛选出一条能够与抗H5 AIV鸡血清特异性反应的抗原表位多肽(H5‑1)。将该抗原表位多肽用于H5亚型禽流感病毒的检测，结果表明由该抗原表位多肽建立的ELISA方法适合检测1:200倍稀释的血清样品，符合率试验证明该方法对于H5AIV阴性血清的检测结果均为阴性，对血凝抑制价在log2‑log4之间样本检测符合率为87.6％，对血凝抑制价在log5及以上的样品检测符合率为98.3％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗原表位多肽，尤其涉及H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，本专利技术还涉及该抗原表位多肽在制备诊断或检测禽流感病毒感染药物中的应用，属于分子免疫学领域。
技术介绍
禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种主要在禽类中传播的感染性疾病。AIV感染家禽后可引发呼吸道疾病，造成产蛋下降，严重时可造成100％的死亡率。近年来AIV频繁变异，使得某些突变毒株可直接感染人类并导致人死亡，严重危害公共卫生，并且造成巨大经济损失，因此受到密切关注。现地检测主要通过ELISA试验鸡抗血清中的AIV抗体的存在与否判断鸡群的免疫情况及是否有AIV野毒感染，目前ELISA试验的包被抗原主要为灭活的H5亚型全病毒或纯化的H5亚型HA蛋白。不同亚型之间存在较为严重的交叉反应。因此很多研究开始关注对H5亚型禽流感病毒的抗体检测。AIV为单股负链RNA病毒，分8个节段，有囊膜，病毒粒子呈现多形态，在实验室中多次传代培养后AIV的病毒粒子一般呈球形，直径约为80-120nm。不同亚型的病毒或因宿主的不同，流感病毒粒子也可呈现杆状或丝状结构。AIV病毒囊膜表面镶嵌着两种糖蛋白纤突，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，还嵌有非糖基化的质子通道蛋白(M2)。根据HA蛋白和NA蛋白的区别可以将AIV分为16个HA亚型和9个NA亚型，其中高致病性禽流感仅存在于部分H5和H7亚型中，HA是影响禽流感病毒致病力和宿主范围的关键因素，其一，HA裂解位点处氨基酸的性质影响禽流感病毒对宿主细胞的侵入能力，裂解位点处的氨基酸为碱性氨基酸(Arg或Lys)时HA三聚体可以被水解为HA1和HA2的两部分，其中由HA1构成的头部与宿主细胞唾液酸结合，并进一步介导病毒进入细胞。高致病性禽流感病毒HA裂解为HA1和HA2的裂解位点处的氨基酸为碱性氨基酸，一般由四个或四个以上的碱性氨基酸构成，可以被宿主体内的蛋白酶裂解为HA1和HA2(Skehel,2000；Harrison,2008)。其二，HA头部的受体结合位点与宿主细胞表面SA特异性吸附受到二者结构的影响，HA受体结合位点影响禽流感病毒感染宿主的范围。哺乳动物细胞表面的SA分为α-2,6型SA和α-2,3SA，人呼吸道主要分布α-2,6型SA，禽呼吸道主要分布α-2,3型SA，猪呼吸道α-2,6型SA和α-2,3型SA均有分布。人流感病毒H1、H2、H3亚型的HA受体结合位点特异识别α-2,6型SA受体，禽流感病毒H5、H7、H9亚型的HA受体识别位点特异性吸附α-2,3型SA受体，不同亚型HA蛋白的不同受体结合能力形成了人流感和禽流感病毒的种间屏障，因此宿主细胞是否具有α-2,3型SA受体及病毒HA蛋白是否能有效的吸附该受体决定了病毒对此宿主是否具有感染力。但α-2,6受体和α-2,3受体在猪体内均有分布，故可导致人流感和禽流感同时感染猪，并在猪体内发生重组，产生新的毒株，大了对禽流感的防控难度。抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原蛋白表面能够识别抗体的区域。通常蛋白抗原的表位根据它们的结构和与抗体结合部位的相互作用分为两种类型，即构象表位和线性表位。多肽芯片扫描技术能够通过将已知氨基酸序列原位合成在芯片等固相载体上，肽与肽之间重叠一个或多个氨基酸，通过抗体与多肽反应，选择合适的二抗孵育后，进行信号收集，进而直接获得反应片段的方法，是获得线性表位的最高效、快捷且精准的方法。有研究通过单克隆抗体结合多肽芯片扫描的方法获得了禽流感病毒NS1蛋白的抗原表位(Sun,Wang,Wen,et al.)。因此，本专利技术人开展了HA抗原表位的鉴定工作，以期能够为进一步建立高效的检测禽流感的方法提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供AIV-HA蛋白B细胞抗原表位多肽以及能够区分H5亚型血清抗体的ELISA检测方法。为此，本专利技术通过将H5亚型AIV(A/DuTurkey/England/N28/1973)的HA氨基酸序列以15个氨基酸为单位，每条与前一条重叠14个氨基酸，将多肽采用原位合成方法固定于芯片，用抗H5亚型禽流感病毒鸡血清与其进行孵育后得到有反应的氨基酸区域，反应值最高的4个片段为H5-1(303NSSMPFHNIHPLTIG317，SEQ ID NO.1所示)、H5-2(38KNVTVTHAQDILEKT52，SEQ ID NO.2所示)、H5-3(443VLMENERTLDFHDSN457，SEQ ID NO.3所示)以及H5-4(83CDEFIDVPEWSYIVE97，SEQ ID NO.4所示)。进一步挑取反应值高的4个片段进行评价。合成4个肽段并偶联BSA，分别作为包被抗原将4个多肽包被ELISA板，通过与H1-H15的单因子血清以及新城疫病毒F48E9毒株的免疫鸡血清进行反应发现H5-1抗原表位多肽与抗H5亚型AIV鸡血清能够发生特异性反应，且不受其他亚型流感病毒抗体的影响。H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽均与其他亚型禽流感阳性血清发生交叉反应，干扰试验结果，不能有效分辨抗H5亚型AIV鸡血清。提示H5-1(303NSSMPFHNIHPLTIG317，SEQ ID NO.1所示)为能够区分H5亚型AIV与其他AIV亚型抗体的抗原表位多肽。因此，本专利技术提出了一种能够用来区分H5亚型AIV与其他亚型的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。一种偶联多肽，其含有本专利技术所述的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽。进一步的，本专利技术还提供了编码所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。其中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。含有该核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也在本专利技术的保护范围之内。更进一步的，本专利技术还提供了所述的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽在制备诊断H5亚型禽流感病毒感染试剂中的用途。本专利技术提出的禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽的鉴定为进一步建立高效检测禽流感的方法提供了依据，同时也为研究HA蛋白的结构和功能奠定了基础。以此抗原表位多肽为基础建立的H5亚型AIV抗体检测方法可用于对H5亚型AIV抗体的监测及免疫保护的评价。附图说明图1为HA抗原表位多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应扫描结果；图2为HA抗原表位多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应强度图；图3为4段抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测。A：H5-1抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测；B：H5-2抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测；C：H5-3抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测；D：H5-4抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这本文档来自技高网...

【技术保护点】
H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种偶联多肽，其特征在于含有权利要求1所述的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽。3.编码权利要求1所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。4.如权利要求2所述的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀荣，包红梅，陈化兰，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23