本发明专利技术涉及一种检测试剂盒，特别是用于检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶（N9）特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，包括预包被H7N9神经氨酸酶线形B细胞抗原表位多肽的96孔酶标板、阳性血清、阴性血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液。利用生物信息学软件预测H7N9亚型禽流感病毒浙江株的神经氨酸酶线性B细胞抗原表位，人工合成相应多肽后将其预包被至酶标板；采用多肽-酶联免疫吸附（ELISA）模式，检测血清中的神经氨酸酶特异性抗体，构建多肽-ELISA检测试剂盒。本发明专利技术提供H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肽-ELISA检测方法，无需使用昂贵的PCR仪等设备，具有快速、简便、灵敏、特异性强等优点，能够被基层单位广泛使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种检测试剂盒，特别是用于检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶 (N9)特异性抗体的多肤-酶联免疫吸附化LISA)试剂盒。
技术介绍
禽流感病毒是A型流感病毒属的负链RNA病毒，根据血凝素化emagglutinin，HA)和 神经氨酸酶(Neuraminidase,ΝΑ)的抗原性差异可分成不同亚型，HA有16种抗原型，NA有9种 抗原型，不同的ΗΑ和ΝΑ组成不同的流感病毒亚型。ΝΑ是一种糖蛋白，构成病毒囊膜纤突的重 要成分，能够水解糖末端的唾液酸残基，使病毒颗粒从宿主细胞受体上释放。目前已确认可 感染人的禽流感病毒亚型有册N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、册N2、H7N9、H10N7和H6N1，其中W Η5Ν1最为常见。新型Η7Ν9是2013年爆发的能感染人类的禽流感病毒亚型，人感染后主要表 现为流感样症状，进而发展为肺炎和急性呼吸窘迫综合征等重症，患者重症比例高，致死率 可达29 %，因此引起了社会各界的广泛关注。研制有效的检测试剂和疫苗对Η7Ν9亚型禽流感病毒的防控具有重要意义。神经氨 酸酶作为Η7Ν9禽流感病毒第二个重要的表面抗原，能够诱导机体产生特异性的中和抗体， 血清中的Ν9抗体水平直接反映了机体感染状况。目前，Η7Ν9的检测多采用临床诊断与实验 室诊断相结合的方法来进行，实验室诊断W反转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)为主，所需 仪器价格昂贵，并且对操作者要求较高。因此本领域需要一种快速、简便、灵敏度高、特异性 强、成本低的检测Η7Ν9禽流感病毒特异性抗体的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用多肤-酶联免疫吸附试验的模式，提供一种快速、简便、灵敏 度高、特异性强的检测Η7Ν9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的试剂盒，用于禽流感 病毒的快速检测和流行病学研究。 本专利技术设及一种检测Η7Ν9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肤-酶联免 疫吸附试剂盒，包括预包被特异性抗原表位多肤的96孔酶标板、阳性血清、阴性血清、辣根 过氧化物酶化RP)标记的抗体、样品稀释液、浓缩洗涂液、显色液和终止液。利用生物信息学 软件预测及确定Η7Ν9亚型禽流感病毒浙江株神经氨酸酶的线性Β细胞抗原表位1-SQPETTNTS、2-NYYNETN、3-IQMEERTSRNFNNLTK、4-IRGKHSNGTIHDRSQY、5-DNPRPNDPNIGKCNDPYPGNNNN、6-ALT孤RSKPIQ和7-GRPKEDK，人工合成相应多肤后用包被液稀 释浓度至10~30微克/毫升包被于96孔酶标板，100微升/孔，4°C反应过夜后洗板3次;每孔 加入200微升含1 %牛血清白蛋白的憐酸盐缓冲液进行封闭，37°C解育2小时后洗板3次，惊 干，即为试剂盒中预包被抗原的酶标板;取待测血清加入包被孔，分别W阳性血清作为阳性 对照、阴性血清作为阴性对照，37°C解育1小时后洗板5次;每孔加入100微升1:5000稀释的 HRP-IgG，37°C解育1小时，洗板5次;每孔加入100微升显色液，37°C暗反应15分钟;每孔加入 50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，W阴性对照孔的平均吸光度 值的2.1倍为阔值判定阴阳性。 本专利技术提供的检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肤-酶联免疫 吸附试剂盒，酶标板分别预先包被10~30微克/毫升的N9抗原表位多肤，包被液为碳酸盐缓 冲液，然后用1%的牛血清白蛋白（BSA)憐酸盐缓冲液进行封闭、惊干备用。本专利技术提供的检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肤-酶联免疫 吸附试剂盒，阳性血清是明确感染H7N9的患者血清，阴性血清是未被H7N9感染的正常人血 清。本专利技术提供的检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肤-酶联免疫 吸附试剂盒，试剂盒应保存在-4°C，避免溶剂的反复冻融，同时显色液应避光保存。本专利技术提供的检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肤-酶联免疫 吸附试剂盒，能够特异性地识别血清样本中的H7N9神经氨酸酶特异性抗体。本专利技术通过下列技术方案完成:利用生物信息学软件DNASta冲的Protean程序对H7N9亚型禽流感病毒浙江株的神经氨酸酶氨基酸序列进行分析，根据抗原性、亲水性和表 面可及性指数的加强原则，预测出线形B细胞抗原表位多肤1-SQPETTNTS、2-NYYNETN、3-IQME邸TSRNFNNLTK、4-IRGKHSNGTI皿RSQY、5-DNPRPNDPNIGKCNDPYPGNNNN、6-ALT孤RSKPIQ和 7-GRPKEDK(见附图2)。人工合成相应多肤，用包被液稀释浓度至10~30微克/毫升包被于96 孔酶标板，100微升/孔，4°C反应过夜后洗板3次。每孔加入200微升含1 %牛血清白蛋白的憐 酸盐缓冲液进行封闭，37°C解育2小时后洗板3次，惊干，即为试剂盒中预包被抗原的酶标 板;取待测血清加入包被孔，分别W阳性血清作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37°C 解育1小时后洗板5次;每孔加入100微升1:5000稀释的皿P-IgG，37°C解育1小时，洗板5次； 每孔加入100微升显色液，37°C暗反应15分钟;每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪 测定492纳米的吸光度值，W阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阔值判定阴阳性(见附 图3)。 H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肤-酶联免疫吸附检测试剂盒的 制备方法，具体制备工艺流程图（见附图1 )，其步骤如下：(1)从GenBank下载H7N9禽流感病毒浙江株的神经氨酸酶氨基酸序列，用生物信息 学软件DNAStar中的Protean程序分析该序列的抗原性（AntigenicIndex)、亲水性 (Hy化ophilicityPlot)和表面可及性（SurfaceProbabilityPlot),计算各指数的加权 平均值，ΚΞ者数值均较高为原则预测出潜在的线性B细胞抗原表位。(2)人工合成预测的H7N9神经氨酸酶线形B细胞抗原表位多肤，用包被液稀释各多 肤至10~30微克/毫升后加入96孔酶标板，100微升/孔，4°C反应过夜，用洗涂液洗板3次;每 孔加入200微升含1 %牛血清白蛋白的憐酸盐缓冲液进行封闭，37°C解育2小时，用洗涂液洗 板3次，惊干。 (3)试剂盒所需溶液的制备：[001引包被缓冲液(0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，抑9.6): 1.59克碳酸钢(Na2C03)，2.93克 碳酸氨钢(NaHC03)，加入1000毫升蒸馈水，溶解混匀。憐酸盐缓冲液(0.01摩尔/升PBS，pH7.4):8.0克氯化钢(化C1)，0.2克憐酸二氨钟 化出P〇4)，2.9克憐酸氨二钢(胞2册〇4 · 12出0)和0.2克氯化钟化C1)，加入1000毫升蒸馈水， 溶解混匀。封闭液：1克牛血清白蛋白，加入100毫升PBS洗液，溶解混匀。[001引样品稀释液:PBS中加入1 %牛血清白蛋白及0.1 %吐溫-20，调节抑至7.4。 酶标抗体:市售HRP标记的抗体，1:5000倍稀释后使用。 浓缩洗涂液:含有1 %吐溫-20，pH7.4的100毫摩尔/升PBS，洗涂时稀释10倍使用。 显色本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗体的多肽‑酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于以H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶线性B细胞抗原表位多肽1‑SQPETTNTS、2‑NYYNETN、3‑IQMEERTSRNFNNLTK、4‑IRGKHSNGTIHDRSQY、5‑DNPRPNDPNIGKCNDPYPGNNNN、6‑ALTDDRSKPIQ和7‑GRPKEDK为捕获抗原，包括预包被特异性抗原表位多肽的96孔酶标板、阳性血清、阴性血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；人工合成相应多肽，用包被液稀释浓度至10~30微克/毫升后包被于96孔酶标板，100微升/孔，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育2小时后洗板3次，晾干，即为试剂盒中预包被抗原的酶标板；取待测血清加入包被孔，分别以阳性血清作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37℃孵育1小时后洗板5次；每孔加入100微升1：5000稀释的HRP‑IgG，37℃孵育1小时，洗板5次；每孔加入100微升显色液，37℃暗反应15分钟；每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高孟，罗永能，谢珲，沈立军，姜立民，顾春燕，高丽美，倪红霞，毛子安，
申请(专利权)人：浙江普康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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