重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因。本发明专利技术还公开了上述重组猪流感疫苗株的制备方法及应用。本发明专利技术的重组猪流感疫苗株，在MDCK细胞上具有较高的病毒滴度，经灭活后制备的重组高产细胞灭活疫苗能对欧亚禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供完全有效的免疫保护。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用。
技术介绍
猪流感(Swineinfluenza,SI)是由正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)感染，引起猪出现高热、咳嗽、呼吸困难等症状的高度接触性呼吸道传染病，具有发病率高，传播速度快，死亡率低等特征。有报道表明猪流感病毒感染猪群同时还极易引起其他细菌和病毒的混合感染，如猪繁殖与呼吸障碍综合症、传染性胸膜肺炎、猪链球菌等，使疫情变得更加复杂，对疾病控制造成巨大困难。目前引起猪发病的SIV亚型主要为H1N1、H1N2和H3N2，主要包括欧洲禽源H1N1亚型SIV、古典的H1N1亚型、重组H1N2亚型SIV、人源H3N2亚型SIV及重组H3N2亚型SIV等。研究表明猪的呼吸道上皮细胞表面同时存在人流感病毒受体SAα-2，3-Gal(唾液酸α-2，3半乳糖苷)和禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)受体SAα-2,6-Gal(唾液酸α-2，3半乳糖苷)，在流感病毒传播中，猪被认为是病毒基因重组的潜在“混合器”和新的流行毒株产生的“孵育器”，也是流感病毒跨越种间屏障传播的重要中间宿主之一。因此防控SIV对预防猪群爆发流感病毒及继发其他细菌和病毒感染具有重要意义的同时，同样对指导和防控人与禽的流感病毒起到积极的辅助作用。目前，技术上成熟且应用广泛的SI疫苗主要是油佐型的H1N1亚型和H3N2亚型的单价或者多价全病毒灭活疫苗，SI全病毒灭活疫苗虽然具有高效、操作简单、成本较低等优点，但是也存在产生抗体较慢、应激反应强等不足。特别是疫苗种毒大多来自于流行毒株，一旦疫苗制备过程发生病毒泄漏，容易诱发新的疫情，给疾病防控带来很大不便。此外，目前国内外生产流感疫苗仍主要采取鸡胚接种培养法，鸡胚接种虽然操作简单，储备经验丰富，但是不可避免的带来耗时量大，消耗量多，生产过程易产生污染，质量难以保障，收毒后的鸡胚难处理等缺点，另外流感病毒在鸡胚传代接种中常会发生抗原变异，影响疫苗效果。有报道，1997年香港感染人的H5N1禽流感病毒能使鸡胚产生巨大细胞病变以至于很难用鸡胚来增殖产生疫苗。而流感病毒在普通MDCK细胞上适应性普遍较低，这阻碍其进一步发展和使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，其包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，该重组猪流感疫苗株不仅能够通过细胞培养大量生产，而且由该重组疫苗株制备的灭活疫苗能够刺激机体短时间内即产生高水平的抗体。此外，还需要提供一种上述重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株的制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种重组猪流感疫苗株，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，所述猪流感病毒SH1株的HA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述猪流感病毒SH1株的NA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，所述猪流感病毒SH1株的HA基因具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。优选的，所述猪流感病毒SH1株的NA基因具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组载体，包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA或NA基因，所述HA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述NA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。所述重组载体为重组质粒载体，其空载体为PBD载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组猪流感疫苗株的制备方法，包括以下步骤：构建分别包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA基因和NA基因的重组载体；将所述含HA基因的重组载体和含NA基因的重组载体，与分别包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP、NS内部基因的六个质粒一起转染293T细胞，培养转染后的细胞；将培养的细胞上清接种于MDCK细胞，待MDCK细胞出现病变后收集病毒液，检测该病毒液的血凝效价，如果有血凝活性，并且经序列分析确定没有非预期突变后，即获得重组猪流感疫苗株。在本专利技术的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，包含：上述重组猪流感疫苗株的灭活疫苗，以及佐剂或药用载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述重组猪流感疫苗株在制备预防或治疗猪流感的疫苗中的应用。本专利技术重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，与野生株病毒相比，在细胞上有更强的复制能力，能达到更高的病毒滴度，而且通过小鼠免疫和攻毒实验证实，该重组疫苗株制备的灭活疫苗首免后的第2周即能获得较高的抗体效价，并能针对欧亚禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供完全有效的免疫保护。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株SH1的NA和HA基因PCR扩增产物电泳图；图2是本专利技术实施例1欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株SH1的NA和HA基因菌液PCR鉴定结果图；图3是本专利技术实施例2病毒以0.001MOI接种MDCK细胞后的生长曲线图；图4是本专利技术实施例2病毒以0.001MOI接种SPF鸡胚后的生长曲线图；图5是本专利技术实施例2病毒蚀斑检测结果图；图6是本专利技术实施例3血凝抑制(HI)抗体检测结果图；图7是本专利技术实施例3中和抗体效价图；图8是本专利技术实施例3的lgG抗体效价图；图9是本专利技术实施例3攻毒后第3、5天小鼠肺脏组织病毒滴度柱状图；图10是本专利技术实施例3攻毒14天后小鼠的体重变化图；图11是本专利技术实施例3攻毒后14天小鼠的存活率图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。本专利技术以欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料，采用RT-PCR扩增HA和NA基因，并将其克隆至PBD载体中，构建HA和NA基因的重组质粒。将该HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)(PR8)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组猪流感疫苗株，其特征在于，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，所述猪流感病毒SH1株的HA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述猪流感病毒SH1株的NA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组猪流感疫苗株，其特征在于，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，所述猪流感病毒SH1株的HA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述猪流感病毒SH1株的NA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组猪流感疫苗株，其特征在于，所述猪流感病毒SH1株的HA基因具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的重组猪流感疫苗株，其特征在于，所述猪流感病毒SH1株的NA基因具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。4.一种重组载体，其特征在于，包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA或NA基因，所述HA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述NA基因的核苷酸序列选自：(1)编码SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海，童光志，阮宝阳，宫晓倩，李泽君，汪秀会，刘晓敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31