一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所述的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗是以杆状病毒为载体，能够在脊椎动物体内表达禽流感病毒主要保护性抗原的重组杆状病毒。制备成经肌肉注射免疫的禽流感基因工程疫苗。该疫苗克服了灭活苗依赖鸡胚生产、生产周期长、存在其他抗原混合感染等方面的不足，为筛选H7N9亚型禽流感疫苗提供技术储备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于正黏病毒科流感病毒属，一直以来对养殖业和人类公共安全造成了严重危害。2013年H7N9亚型AIV的暴发，更引发了全球对AIV的关注。H7N9AIV虽然对禽类呈现低致病性，感染后一般不表现出临床症状，呈带毒状态，但对人具有较强的致病性。为有效控制禽类感染该亚型AIV，亟待研究有效预防禽源H7N9流感病毒的疫苗。给易感动物免疫合适的疫苗可以保护易感禽类免于潜在的感染，还可以减少感染动物的排毒和病毒的传播能力。H7N9亚型禽流感病毒的抗原性与以往流行的禽流感病毒不同，原有的季节性流感疫苗和禽流感疫苗对其缺乏免疫保护作用，目前应用最为广泛的是油乳剂灭活苗，传统的油乳剂灭活苗虽能够诱导免疫动物产生足够的免疫保护作用，但是也存在一些缺陷：疫苗生产过度依赖鸡胚，在流感暴发时鸡胚产量受到限制；存在其它抗原污染的可能性；灭活苗免疫后产生的抗NP或M1蛋白抗体不能把免疫和野毒感染产生的抗体区分开来。而弱毒活疫苗具有感染性，存在生物安全隐患，目前尚不允许在禽类中使用。基因工程疫苗不会干扰禽流感病毒的血清学调查，而且不存在毒力返强、散毒和环境污染等问题。杆状病毒表达系统能够高效的表达外源基因，作为一种真核表达系统，在外源基因表达方面具有加工、修饰、并将蛋白正确的定位且形成高级结构，其表达产物与天然产物的生物学特性相似。杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，并且已经重组后的病毒因失去病毒粒子的天然保护物多角体蛋白结晶体，病毒粒子极易在自然环境中失活，不会产生对环境及人畜的污染，因而重组杆状病毒被认为是安全的表达载体。杆状病毒表达载体的应用主要有两种表达形式，一种携带有哺乳动物细胞活性基因表达盒，能转导哺乳动物细胞的杆状病毒，通常称作BacMan病毒。另一种是表面展示重组蛋白的杆状病毒。随着研究的逐步深入，杆状病毒本身可以作为佐剂，增强对多种感染性病原的保护性免疫应答这一事实变得越来越清楚。近年来研究发现，杆状病毒可以转导不同来源的许多细胞，所以携带不同启动子、不同抗原的重组BacMan病毒已经被开发应用于疫苗。通过启动子如人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子将杆状病毒外源基因转入细胞中进行表达。研究显示，利用杆状病毒表达系统生产H5亚型、H7亚型的重组HA疫苗，免疫10日龄仔鸡，对免疫组攻击致死性禽流感强毒，结果免疫鸡都不发病，未免疫组攻毒后全部死亡；刘明等分别构建了杆状病毒转移载体，表达了禽流感病毒H5N1的HA基因和NA基因以及H7N1的HA基因，免疫SPF鸡后用禽流感病毒攻击，可提供一定程度的保护。
技术实现思路
为克服现有技术中存在的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗。本专利技术的另一目的在于提供上述以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，包括重组修饰的杆状病毒，所述的杆状病毒能够表达禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白。所述的禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白包括H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白HA的全长，所述的禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中双启动子基因盒被替换，所述双启动子基因盒如下组件：多角体蛋白(Polyhedron,PH)启动子被巨细胞病毒早期增强子启动子替换，巨细胞病毒早期增强子表达盒下游为主要保护性抗原血凝素蛋白HA，P10启动子被巨细胞病毒早期增强子表达盒替换，巨细胞病毒早期增强子表达盒下游为主要保护性抗原血凝素蛋白HA；得到含双CMV启动子双向表达的重组核苷酸序列HA-CMV-CMV-HA,其中CMV-HA核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中双启动子基因盒被替换，是以pFastBacTMDual(购自于Invitrogen公司)为骨架质粒，pcDNA3.1(+)(购自于Invitrogen公司)为材料，通过下述方法获得：以pcDNA3.1(+)质粒为模板，PCR扩增CMV序列，其上下游带有BstZ17I和BbsI酶切位点，用BstZ17I和BbsI酶切扩增片段CMV，回收包含663bp的片段，置换pFastBacTMDual的P10启动子，得到中间质粒pFast-CMV；以pcDNA3.1(+)质粒为模板，PCR扩增CMV序列，其上下游带有BstZ17I和BamHI酶切位点，用BstZ17I和BamHI酶切扩增片段CMV，回收包含663bp的片段，置换中间质粒pFast-CMV的多角体启动子，最终获得质粒pFast-(CMV)2，实现重组修饰的昆虫杆状病毒的基因组中双启动子基因盒被替换；其中CMV启动子核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的重组修饰的杆状病毒的构建所用的出发载体为pFastBacTMDual。所述的杆状病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。所述的重组修饰的杆状病毒命名为重组杆状病毒BV-(CHA)2。上述的以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：首先通过对H7N9亚型禽流感病毒的HA基因的生物信息学软件分析，获得编码H7N9流感病毒HA蛋白的基因的全长序列，分别在重组修饰的杆状病毒供体质粒pFast-(CMV)2两边的多克隆位点依次插入流感病毒基因组HA，得到含双CMV启动子双向表达的重组杆状病毒转移质粒pFast-(CHA)2；将重组转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-(CHA)2；最后用脂质体法将Bacmid-(CHA)2转染sf9昆虫细胞从而获得第一代重组杆状病毒BV-(CHA)2，采用sf9细胞培养和重组杆状病毒增殖，结合超速离心分离技术，纯化得到以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗。上述以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗的应用，应用于制备H7N9亚型禽流感疫苗。本专利技术利用人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子构建了杆状病毒双CMV表达载体，选择H7N9亚型AIV的HA基因为靶基因，构建了表达HA蛋白的重组杆状病毒BV-(CHA)2，携带HA基因的重组杆状病毒通过转导作用，能在动物细胞内得到高效表达，类似于DNA疫苗。将此重组杆状病毒疫苗进行SPF鸡的免疫保护效力评价。以上内容为研制H7N9亚型禽流感疫苗提供了新的思路，也为有效预防H7N9亚型AIV建立了必要的技术储备。本专利技术与现有技术相比具有如下的优点：本专利技术提供一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，该H7N9亚型禽流感疫苗包括重组修饰的杆状病毒，所述的杆状病毒能够表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素HA蛋白。经肌肉注射免疫，使用方便；在诱导细胞免疫方面占优势；疫苗制备简单，便于大批量生产。本专利技术选择将H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，其特征在于：包括重组修饰的杆状病毒，所述的杆状病毒能够表达禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，其特征在于：包括重组修饰的杆状病毒，所述的杆状病毒能够表达禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白。2.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，其特征在于：所述的禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白包括H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白HA的全长，所述的禽流感病毒主要保护性抗原HA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，其特征在于：所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中双启动子基因盒被替换，所述双启动子基因盒如下组件：多角体蛋白启动子被巨细胞病毒早期增强子启动子替换，巨细胞病毒早期增强子启动子下游为主要保护性抗原血凝素蛋白HA，P10启动子被巨细胞病毒早期增强子启动子替换，巨细胞病毒早期增强子表达盒下游为主要保护性抗原血凝素蛋白HA；得到含双CMV启动子双向表达的重组核苷酸序列HA-CMV-CMV-HA，其中CMV-HA核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的H7N9亚型禽流感基因工程疫苗，其特征在于：所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中双启动子基因盒被替换，是以pFastBacTMDual为骨架质粒，pcDNA3.1(+)为材料，通过下述方法获得：以pcDNA3.1(+)质粒为模板，PCR扩增CMV序列，其上下游带有BstZ17I和BbsI酶切位点，用BstZ17I和BbsI酶切扩增片段CMV，回收包含663bp的片段，置换pFastBacTMDual的P10启动子，得到中间质粒pFast-CMV；以pcDNA3.1(+)质粒为模板，PCR扩增CMV序列，其上下游带有BstZ17I和BamHI酶切位点，用BstZ17I和BamHI酶切...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖明，张娇，樊惠英，章震，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44