一种重组表达PEDVS蛋白受体RBD结构域的PRRSV活载体疫苗株的构建及应用制造技术

本发明专利技术提供一种重组表达PEDV S蛋白受体RBD结构域的PRRSV活载体疫苗株的构建及应用，结果表明拯救出的重组病毒rHuN4

【技术实现步骤摘要】
一种重组表达PEDV S蛋白受体RBD结构域的PRRSV活载体疫苗株的构建及应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，涉及一种重组表达PEDV S蛋白受体RBD结构域的优势抗原表位肽的PRRSV活载体疫苗株的构建及应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是造成世界养猪业巨大经济损失的一种高度接触性肠道传染病，在新生仔猪群中流行广泛且危害严重，对世界养猪业者造成了重大经济损失。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起该病的主要病原，PEDV可以感染所有年龄的猪并引起临床症状，但感染猪的严重程度和死亡率与猪年龄成反比，其中对10日龄以内新生哺乳仔猪影响最大，主要表现为水样腹泻、呕吐、脱水、消瘦和死亡等，对新生哺乳仔猪发病率和致死率甚至可高达80
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100％。PEDV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，α
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冠状病毒亚群的成员。2010年年底新出现了一种变异的PEDV毒株，对新生哺乳仔猪致病力强，且传播速度快，导致哺乳仔猪群大面积暴发急性腹泻疫情，发病率和死亡率居高不下。由于发生变异的PEDV传播速度快，感染性强，使其成为当前对新生仔猪威胁最大的头号病毒性传染病。目前人们将2010年以前的PEDV分离株归为G1亚群，而2010年以后PEDV变异毒株被归为G2亚群。
[0003]PEDV基因组长约28kb，包含5
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和3
′
非翻译区(UTR)和至少7个开放阅读框(ORF)，依次为ORF1a、ORF1b、刺突蛋白(S)、辅助蛋白ORF3、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。其中ORF1在5
′
末端约占基因组全长的三分之二，编码两种多聚蛋白pp1a和pp1ab，pp1a和pp1ab被木瓜蛋白酶和3C样丝氨酸蛋白酶切割为16个非结构蛋白NSP1
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16，这些NSPs主要参与病毒复制、转录、翻译和病毒蛋白加工。PEDV S糖蛋白位于病毒颗粒的表面，是一种同源三聚体膜糖蛋白，由S1和S2两个亚基组成，S1介导PEDV与宿主受体结合，S2诱导膜融合和PEDV入侵。S1蛋白的N端(NTD)具有神经氨酸酶结合活性，C端(CTD)包含细胞受体结合功能域(RBD)，主要负责识别宿主细胞面受体，并介导病毒吸附，针对PEDV RBD的抗体可以抑制PEDV S蛋白识别宿主细胞受体，因此RBD区域也是病毒感染过程中宿主免疫防御的主要靶点，通常被用作疫苗开发的靶标。
[0004]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种具有重要经济意义的传染病，其主要临床症状是各年龄段猪发生呼吸道疾病和母猪繁殖障碍。PRRS的病原体是猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)，自1987年首次报道以来，PRRSV一直是全球养猪业面临的主要挑战之一，并且仍然在不断发生变异导致新的流行，据报道仅在美国，PRRSV感染每年给养猪业可造成约6.64亿美元的损失。PRRSV也是一种单股正链RNA病毒，PRRSV感染的靶细胞主要是单核
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巨噬细胞，其中最典型的是肺泡巨噬细胞(PAMs)。PRRSV主要有两种基因型，即PRRSV1和PRRSV2，两种基因型毒株之间核苷酸和氨基酸的同源性分别仅为60％和56％，但两种类型毒株所引起的临床症状、病理损伤特点和组
织嗜性等都是相似的。其中PRRSV1在欧洲流行普遍，PRRSV2在美洲和亚洲流行普遍，但在欧洲、北美州和亚洲也同时存在这两种类型毒株分离的报道。目前，在我国猪群中流行的主要是以PRRSV2毒株为主，由于PRRSV容易发生变异和重组，临床上流行的PRRSV毒株也复杂多样，呈现包括经典的CH
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1a类PRRSV、高致病性PRRSV、NADC30
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like和NADC34
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like PRRSV等不同亚型毒株共存的现象，同时，还存在由这上述不同毒株发生重组而来新的变异毒株。因此PRRSV也是我国养猪业中最受困扰的病毒之一。
[0005]PRRSV和PEDV的混合感染在我国较为普遍，为了控制PRRS和PED，除了加强生物安全管理措施而外，疫苗接种是目前最常用和最为有效预防PRRS和PED的策略之一，通过疫苗接种能够最大限度地减少由PRRSV和PEDV感染造成的经济损失。目前用于预防PRRS和PED的疫苗主要包括活疫苗和灭活疫苗，其中PRRSV灭活疫苗虽然安全，但其提供的免疫保护有限，活疫苗能够提供有效的免疫保护。但是针对不同病原的感染，尚无疫苗可同时预防PED和PRRS。而依赖单一疫苗的频繁免疫接种，不仅增加了疫苗接种成本，而且会对猪群造成过度的免疫应激，影响猪的生产性能，因此，有必要设计一种多价疫苗以用于同时预防PRRSV和PEDV两种不同病原的感染。S蛋白位于病毒颗粒的表面，可介导识别受体和膜融合，含有能够诱导产生中和抗体的中和性抗原表位，是研发冠状病毒候选疫苗的理想抗原。但是并非S蛋白中所有的抗原表位都能诱导产生中和性抗体，已有研究证实在完整的S蛋白或S1蛋白中还存在很多诱导非中和抗体的抗原表位，而非中和性抗体中也包含与病毒感染的抗体依赖性增强(ADE)相关或与有害免疫反应相关的抗体，潜在不可控的风险因素比较多，对于安全高效疫苗的研发是不利的。PEDV入侵宿主细胞主要依赖S蛋白利用其受体结合结构域(RBD)与宿主细胞受体结合，使病毒进入宿主细胞，由此可见，针对靶向S蛋白RBD区域的中和抗体能够阻断S蛋白与受体的结合，从而阻止PEDV感染。PRRSV弱毒疫苗HuN4
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F112株在临床上已被广泛用于预防高致病性PRRSV的感染，且已证实PRRSV基因组适合作为表达外源基因的载体，但其容纳外源基因大小是有限的，引入的外源基因过大，会导致外源基因突变或丢失，容易造成重组病毒的遗传不稳定，因此，选择适当大小的外源基因是构建重组疫苗的关键。本研究旨在PRRSV活疫苗株HuN4～F112的基础上，有针对性性的选择主要包含RBD结构域的PEDV S蛋白CTD结构域作为靶抗原，减少了大量冗余抗原表位，最大限度地降低ADE效应的风险因素，构建能够稳定重组表达PEDV S蛋白优势抗原区域的PRRSV弱毒疫苗株，该疫苗株能够诱导机体产生集中靶向PEDV RBD结构域的中和抗体，阻止病毒对宿主细胞受体的识别，从而降低病毒的感染能力，为PRRS和PED的防控提供技术支撑。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是：
[0007]提供一种针对PEDV的S蛋白受体RBD结构域的融合抗原表位肽，所述S蛋白RBD功能域的优势抗原区域是根据Gene Bank中公布的PEDV流行变异毒株FJzz1株S基因序列(登录号：MK288006)，利用DNASTAR软件进行氨基酸序列的分析，选择位于S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对PEDV的S蛋白受体RBD结构域的融合抗原表位肽，所述S蛋白RBD功能域的优势抗原区域是根据Gene Bank中公布的PEDV流行变异毒株FJzz1株S基因序列(登录号：MK288006)，利用DNASTAR软件进行氨基酸序列的分析，选择位于S基因中S1亚基的C端结构域(1495
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2377nt，编码氨基酸位置：aa 496
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792)，该区域主要分布于S蛋白胞外域三聚体的表面，包含PEDV潜在的RBD结构域，抗原性指数最高3.4，并在其前端引入S基因的信号肽序列，将该目的基因命名为RBD1，如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的针对PEDV的S蛋白受体RBD结构域的融合抗原表位肽，所述抗原表位肽N端或C端还可以偶联有多肽标记；所述多肽标记为生物素标记或荧光标记。3.如权利要求1所述的针对PEDV的S蛋白受体RBD结构域的融合抗原表位肽在制备针对PRRS和PED的二价基因工程活疫苗中的应用。4.一种表达权利要求1所述针对PEDV的S蛋白受体RBD结构域的融合抗原表位肽的重组PRRSV pHuN4
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F112
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SRBD1疫苗株，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：周艳君，童光志，劳梦琴，陈鹏飞，虞凌雪，高飞，姜一峰，刘长龙，童武，李国新，于海，李丽薇，郑浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：