TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白及其制备方法与应用。本发明专利技术将TW型IBV

【技术实现步骤摘要】
TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地说，涉及TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病可发生于各年龄段的鸡，其中雏鸡感染后临床症状最为严重，主要表现为甩头、咳嗽和呼吸困难等症状，某些肾型IBV毒株感染也可造成鸡只的严重肾炎。IBV传播速度快、传播范围广，血清型和基因型众多，给世界养禽业造成巨大经济损失。IBV属巢氏病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、gammacoronavirus属，单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为27.6kb，病毒基因组5
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端的三分之二编码非结构蛋白1a/1b，参与病毒复制和翻译等功能，3
’
端三分之一的序列编码结构蛋白，刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleotide protein)，此外还有辅助蛋白：3a、3b、5a和5b，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、C端结构域(CTD)、SD1和SD2，自然状态下，S1呈三聚体结构，其中NTD是已经证明与唾液酸结合的结构域，主要负责与宿主细胞表面的唾液酸糖结合，从而介导病毒侵染宿主细胞。因此，S1蛋白及NTD均为目前宿主抗体检测和基础研究的主要靶标。
[0003]目前，IBV血清型众多，临床上流行的IBV毒株主要是QX型，其次为TW型，均给养禽业带来了较大损失，而当前国内所用疫苗株多为Mass型。不同血清型毒株的抗体针对S1
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NTD区域交叉反应性差，现有的抗体检测试剂不能针对特定血清型抗体水平进行检测，不能反映鸡群真实的抗体水平，给临床防控该病带来了很大障碍。现已经有针对QX型IBV流行毒株抗体水平的ELISA试剂盒，因此，模拟IBV
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S1
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NTD的天然结构，为后期针对TW
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IBV的抗体ELISA检测方法的建立和相关基础研究有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白及其制备方法与应用。
[0005]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含顺次串联连接的IL
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2ss分泌性信号
肽
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TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域
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异亮氨酸拉链基序
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人IgG1的Fc片段。
[0006]进一步地，所述重组融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
[0007]i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
[0008]ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
[0009]iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
[0010]第二方面，本专利技术提供编码所述重组融合蛋白的核酸分子，经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]第三方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
[0012]第四方面，本专利技术提供所述重组融合蛋白的制备方法，将编码所述重组融合蛋白的核酸分子构建到真核表达载体上，导入HEK293细胞，培养后收获上清，并进行目的蛋白纯化。
[0013]第五方面，本专利技术提供TW型禽传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法(含非疾病诊断目的)，包括以下步骤：
[0014]步骤1：将所述重组融合蛋白以0.5μg/mL的包被浓度加入酶标板，每孔100μL，包被条件为4℃过夜，然后用PBST缓冲液清洗酶标板(洗3次，每次3min)；
[0015]步骤2：向酶标板的每孔加200μL的质量百分数为5％的脱脂奶粉进行封闭，4℃封闭过夜，然后用PBST缓冲液清洗酶标板(洗3次，每次3min)；
[0016]步骤3：用质量百分数为5％的脱脂奶粉稀释待测血清作为一抗，向步骤2得到的酶标板的每孔加入100μL一抗，待测血清的稀释度为1:100，37℃反应60min，然后用PBST缓冲液清洗酶标板(洗3次，每次3min)；
[0017]步骤4：将质量百分数为5％的脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鸡IgG作为二抗，稀释倍数为1:10000，向步骤3得到的酶标板的每孔加100μL酶标二抗，反应60min，然后用PBST缓冲液清洗酶标板(洗5次，每次3min)；
[0018]步骤5：步骤4得到的酶标板的每孔避光加入100μL单组分TMB底物，37℃避光反应10min，每孔加入50μL终止液，震荡混匀，采用终点法，检测波长450nm，用酶标仪检测OD
450
值(450nm吸光度值)；
[0019]步骤6：当OD
450
值≥0.45时，判定为阳性，当OD
450
值＜0.38时，判定为阴性；当0.45＞OD
450
值≥0.38时，为可疑，需重测，重测结果OD
450
值≥0.38时为阳性，否则为阴性。
[0020]优选地，步骤5中所述终止液为1mol/L H2SO4。
[0021]本方法可用于TW型禽传染性支气管炎病毒阳性血清与其他血清型(如Mass型、QX型)禽传染支气管炎病毒感染的鉴别诊断。本专利技术所述重组融合蛋白不与Mass型禽传染性支气管炎病毒M41株、H120株和QX型禽传染性支气管炎病毒SD株抗体阳性血清发生反应。
[0022]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0023]本专利技术提供了三聚体化传染性支气管炎病毒
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S1
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N端结构域重组融合蛋白、其制备方法和应用。首先对TW
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IBV
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S1蛋白的基因序列进行设计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白包含顺次串联连接的IL
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2ss分泌性信号肽
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TW型禽传染性支气管炎病毒S1蛋白N端结构域
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异亮氨酸拉链基序
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人IgG1的Fc片段。2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。3.编码权利要求1或2所述重组融合蛋白的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。5.含有权利要求3或4所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。6.权利要求1或2所述重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，将编码权利要求1或2所述重组融合蛋白的核酸分子构建到真核表达载体上，导入HEK293细胞，培养后收获上清，并进行目的蛋白纯化。7.TW型禽传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将权利要求1或2所述重组融合蛋白以0.5μg/mL的包被浓度加...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵烨，游人荣，张国中，唐丽华，赵静，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：