【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原菌分离，具体涉及一种抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用。
技术介绍
1、肠炎沙门菌作为重要的人畜共患病原菌，其常规的检测方法费时耗力、仪器昂贵，不能满足检测需求，因此目前市场急需开发肠炎沙门菌的快速检测技术。目前针对肠炎沙门菌的检测方法主要有gb 4789.4-2016检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法是重要的检测方法之一，单克隆抗体因其特异性强，效价高，化学性质稳定，一直是免疫学检测方法的重要工具。
2、本研究利用灭活的肠炎沙门菌作为免疫原，免疫balb/c小鼠。通过杂交瘤技术制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，elisa方法筛选效价高、特异性强的阳性细胞株，经过4次亚克隆后得到稳定分泌抗金葡菌抗体的细胞株。扩大培养后注入小鼠腹腔，收集腹水，制备单克隆抗体，elisa方法测定腹水的效价和特异性，通过简易过碘酸钠标记法测定不同抗体间与抗原表位的结合是否相互影响，通过亚型测定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型，为后续肠炎沙门菌的免疫磁珠制备奠定基础。
3、磁珠富集技术，是利用表面覆盖特定官能团的纳米级磁珠与具有某种特定性状的生物化学分子通过共价或非共价方式偶联，进而与目标物发生特异性结合，通过磁响应将目标物从溶质中分离出来的技术。免疫磁珠因其在免疫学检测上的独特优势，一直在食源性检测领域发挥着重要的作用。
4、现有技术中部分专利申请涉及使用抗体免疫磁珠进行肠炎沙门菌的富集，然而其中所用抗体为人igg，因而难以保证检测方法的特异性，由此进一步地
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的富集肠炎沙门菌的抗体免疫磁珠特异性与捕获率、敏感度难以兼顾等缺陷，提供一种抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用。
2、本专利技术技术方案的第一方面提供一种抗肠炎沙门菌的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的lcdr1包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，lcdr2包含氨基酸序列kvs，lcdr3包含如seq id no:2所示的序列；所述重链可变区的hcdr1～hcdr3分别包含如seq id no:3、4和5所示的序列。
3、较佳地，所述轻链可变区包含如seq id no:6所示的序列，所述重链可变区包含如seq id no:8所示的序列。
4、更佳地，所述单克隆抗体还包括鼠重链恒定区和鼠人轻链恒定区，所述鼠重链恒定区优选igg1，所述鼠轻链恒定区优选kappa型。
5、进一步更佳地，所述的单克隆抗体的轻链包含如seq id no:7所示的序列，重链包含如seq id no:9所示的序列。
6、本专利技术中，抗体可变区cdr的编号/定义规则采用了imgt，基于同样的抗体序列以其他规则例如kabat、abm、chothia或contact获得的可变区或cdr的技术方案仍属于本专利技术保护的范围。
7、本专利技术技术方案的第二方面提供一种分离的核酸，其编码如第一方面所述的单克隆抗体。
8、优选地，编码所述重链的核酸包括如seq id no:11所示的核苷酸序列，编码所述轻链的核酸包括如seq id no:10所示的核苷酸序列。
9、本专利技术技术方案的第三方面提供一种重组表达载体，其包括如第二方面所述的核酸。
10、本专利技术技术方案的第四方面提供一种转化体，其包含如第二方面所述的核酸或第三方面所述的重组表达载体。
11、优选地，所述转化体的宿主细胞为哺乳动物细胞或大肠杆菌。
12、本专利技术技术方案的第五方面提供一种制备单克隆抗体的方法，其在适合如第四方面所述的转化体生长的条件下培养所述转化体，使其表达所述的单克隆抗体。
13、本专利技术技术方案的第六方面提供一种单克隆抗体免疫磁珠，其包含如第一方面所述的单克隆抗体。
14、所述的单克隆抗体免疫磁珠可通过本领域常规的制备方法进行制备。
15、在一些优选的实施例中，制备其的方法包括使用活化的免疫磁珠偶联所述的单克隆抗体。
16、在一些更优选的实施例中，所述活化使用包括edc和nhs的混合液；优选所述edc和nhs的比例为1:1，和/或，在37℃、200rpm活化30min。
17、在另一些优选的实施例中，所述偶联包括将所述活化的免疫磁珠与所述单克隆抗体共培养，以使二者发生偶联。
18、在另一些更优选的实施例中，所述偶联包括以下步骤中的一种或多种：
19、(1)用mest缓冲液、ph 6.0重悬活化的免疫磁珠；优选重复3次；
20、(2)用mest缓冲液、ph 7.0重悬活化的免疫磁珠，弃上清后重复1次；优选所述mest缓冲液的浓度为0.025mol/l；
21、(3)加入所述单克隆抗体，混匀后重悬，使与活化的免疫磁珠偶联，弃上清获得单克隆抗体免疫磁珠；优选30r/min室温活化3h；
22、(4)用mest缓冲液、ph 7.4重悬单克隆抗体免疫磁珠，弃上清；优选重复3次；
23、(5)用封闭液优选含1％bsa的0.01mol/l pbst、ph 7.4封闭，弃上清；
24、(6)用pbst缓冲液、ph 7.4重悬，弃上清；优选重复4次；
25、(7)用含0.02％nan3和0.5％bsa的0.01mol/l pbst、ph 7.4重悬。
26、在一些优选的实施例中，所述免疫磁珠可为本领域常规，例如pm3-020(直径180nm)、pm3-050(直径700nm)和sm3-d100(直径1150nm)，较佳地为直径100～200nm的免疫磁珠，更佳地为180nm的免疫磁珠。
27、本专利技术技术方案的第七方面提供一种如上第一方面所述的单克隆抗体、第二方面所述的单克隆抗体免疫磁珠在检测肠炎沙门菌或制备检测肠炎沙门菌的诊断剂中的应用。
28、本专利技术技术方案的第八方面提供一种检测肠炎沙门菌的方法，其包括以下步骤：
29、(1)按照肠炎沙门菌检验国际方法中的样品前处理办法处理样品，将如上所述的单克隆抗体免疫磁珠与所述样品在偶联缓冲液中孵育，例如孵育40～50min；
30、(2)计算捕获率。
31、较佳地，所述方法为非诊断目的的方法。
32、在一些优选的实施例中，步骤(1)中所述的偶联缓冲液优选mest缓冲液；所述mest缓冲液的浓度优选0.025m，ph优选7.0。
33、在本专利技术一较佳实施方案中，步骤(1)中所述样品在偶联缓冲液中孵育15～75min，优选45min。
34、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗肠炎沙门菌的单克隆抗体，其特征在于，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列KVS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的单克隆抗体；优选地，编码所述重链的核酸包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，编码所述轻链的核酸包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包括如权利要求3所述的核酸。
5.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的重组表达载体；优选地，所述转化体的宿主细胞为哺乳动物细胞或大肠杆菌。
7.一种单克隆抗体免疫磁珠，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的单克隆抗体；
8.如权利要求7所述的单克隆抗体免疫磁珠，其特征在于，所述偶联包括将所述活化的免疫磁珠与所述单克隆抗体共培养，以使二者发生偶联；
9.一种如权利要求1或2所述的单克隆抗体，或如权利要求7或8所述的单克隆抗体免疫磁珠在检测肠炎沙门菌或制备检测肠炎沙门菌的诊断剂中的应用。
10.一种检测肠炎沙门菌的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种抗肠炎沙门菌的单克隆抗体，其特征在于，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的lcdr1包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，lcdr2包含氨基酸序列kvs，lcdr3包含如seq id no:2所示的氨基酸序列；所述重链可变区的hcdr1～hcdr3分别包含如seq id no:3、4和5所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seq id no:8所示的氨基酸序列；
3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的单克隆抗体；优选地，编码所述重链的核酸包括如seq id no:11所示的核苷酸序列，编码所述轻链的核酸包括如seq id no:10所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩先干，李师莹，张海洋，蒋蔚，宋小凯，龚建森，苗晋锋，陈兆国，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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