【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，涉及一种套索肽的表达、制备和纯化，以及利用该产物进行微生物被膜抑制的应用。
技术介绍
1、生物污损(biofouling)具有形成迅速、污染严重、难以清除的特点，给海洋产业带来了巨大的经济损失，是世界范围内的共性难题。污损的发生过程与微生物被膜(biofilm)形成紧密相关，biofilm的形成受群体感应信号(quorum sensing，qs)调节。本次专利技术以qs为聚焦点，筛选针对微生物被膜有抑制作用的群体感应抑制剂(quorum sensing inhibit,qsi)，开发具有抗污损潜力的天然产物，结合室内验证试验，评估活性物质的潜在能力。
2、海洋生物污损是指水体微生物、藻类以及小型真核生物等一系列海洋生物附着于一定的基质表面而形成的生物聚集体，其发生过程包含海洋生物的附着、定殖、生长直至腐蚀。因其快速繁殖、广泛累积而又难以清除的特点，给水产养殖、轮船航行、仪器维护等带来了巨大的经济损失。研究表明，每年由于海洋生物污损所造成的直接经济损失高达4,400亿美元，污损事件的严重性阻碍海洋经济发展，在世界范围内广受关注。早期处理生物污损的手段包括物理方法和化学方法两种。物理方法为较直接的机械剥离，易反复且耗时耗力。化学法主要依赖于如三丁基锡(tributyltin,tbt)、氧化亚铜等抑菌化合物的使用，相比物理法，化学方法更加方便快捷。但这类生物毒素易产生次生危害，对海洋生物和生态环境造成潜在危险，破坏海洋生态系统健康。因此，寻求一种安全、无毒和生态友好的治理手段成为现今关注的重点。>
3、在众多方法中，生物法具有独特的优势。在生物治污中尤以微生物为佳，原因在于微生物具有来源广、繁殖快、适应性强的特点。针对性地对菌株进行筛选，寻找活性代谢产物应用于海洋污损的治理是最具前景的研究方向之一。海洋生物污损具有动态演替性，其形成过程与微生物被膜(biofilm)紧密相关，而biofilm的形成受多种信号因子的调节，最典型的是群体感应信号(quorum sensing，qs)。群体感应是广泛存在于微生物间的一种信号传递机制，可作为通讯语言调节菌群的多种生理功能。群体感应抑制剂(quorum sensinginhibit，qsi)是qs系统的特异性信号干扰物，qsi竞争性地阻遏抑制该系统正常的信号交流。通过干扰群落内部的通讯体系可在不杀死或不干扰细菌正常生命活动的前提下有效调控菌群的结构和功能。因此以qsi为切入点，阻断信号分子的作用进而抑制微生物被膜的产生具有理论上的防污依据。另外，开发qsi方法进行抑膜控损，除具备生物治理的普遍优势外，更兼具生态安全性和环境友好性，是一种绿色无污染的手段。
4、套索肽(lasso peptide)是在细菌中发现的一类多肽类天然产物，是由核糖体合成并经过翻译后修饰产生的一类具有套索构型的生物活性肽，因具有互锁套索拓扑结构的特征而命名。与线性肽相比，套索肽具有极好的热稳定性和蛋白酶稳定性。套索肽因其具有抗菌、抗病毒或其他生物活性而被认为是生物制药的研发热点。自1991年首个套索肽anantin被发现以来，以“套索肽”作为主题的研究逐渐受到关注。然而，目前分离鉴定的套索肽数量还非常少。因此，未来的工作重心之一仍然是新的套索肽的鉴定和新功能的开发。异源表达是套索肽研究中最常用的方法。这是因为套索肽在其天然宿主菌中的表达难以在标准培养条件下实现，而且异源表达有利于深入研究套索肽生物合成过程和翻译后修饰。
5、套索肽具有多种生物学活性，如抗菌、抗肿瘤、酶抑制和受体拮抗活性等。目前认为套索肽的抗菌作用主要通过两种机制：其一是作用于细菌细胞膜，在膜上形成离子通道，引起胞内物质外漏而杀死细菌；其二是套索肽不破坏细胞膜而进入胞内，与胞内靶标结合后抑制其代谢，从而杀死细菌。例如，mccj25与细菌外膜受体蛋白fhua结合，进入细菌后抑制rna聚合酶的活性起到杀菌的作用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于寻求一种安全、无毒和生态友好的抗污损方法，针对套索肽的作用以及在生态环境领域的应用稀缺，希望挖掘它的新功效和新应用。
2、本专利技术提供一种套索肽，所述套索肽为如下a1或a2,
3、a1)氨基酸序列为序列4的第23-43位所示的氨基酸序列的套索肽novosphingonodin i，其中，所述套索肽的n-末端的甘氨酸(对应序列4的第23位)的α-氨基与第8位上的谷氨酸(对应序列4的第30位)的羧酸侧链之间形成内酰胺环肽环；
4、a2)氨基酸序列为序列10的第23位-45位所示的氨基酸序列的套索肽novosphingonodin ii，其中，所述套索肽的n-末端甘氨酸(对应序列10的第23位)的α-氨基与第8位上的天冬氨酸(对应序列10的第30位)的羧酸侧链之间形成内酰胺环肽环。
5、其中，编码所述套索肽novosphingonodin i的基因簇包括序列1、序列2和序列3所示的核苷酸序列；编码所述套索肽novosphingonodin ii的基因簇包括序列7、序列8和序列9所示的核苷酸序列。进一步的，所述套索肽novosphingonodin i的基因簇依次由序列1、rbs序列、序列2和序列3所示的核苷酸序列组成。所述套索肽novosphingonodin ii的基因簇依次由序列7、rbs序列、序列8和序列9所示的核苷酸序列组成。
6、所述套索肽在阻断微生物信号传递和/或抑制微生物的群体感应中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
7、所述套索肽在抑制微生物被膜形成和/或防止环境污损发生中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
8、一种套索肽的制备方法，包括将能够表达所述套索肽novosphingonodin i或者套索肽novosphingonodin ii的重组载体导入微生物表达，得到所述套索肽novosphingonodin i或者套索肽novosphingonodin ii的步骤。
9、所述能够表达套索肽novosphingonodin i的重组载体为pet41a-nova1-rbs-b1c1，所述能够表达套索肽novosphingonodin ii的重组载体为pet41a-nova2-rbs-b2c2。
10、所述重组载体pet41a-nova1-rbs-b1c1通过点突变技术将重组质粒pet41a-nova1b1c1的nova1和novb1之间的序列分别替换为优化的大肠杆菌核糖体结合位点得到的；重组载体pet41a-nova2-rbs-b2c2通过点突变技术将重组质粒pet41a-nova2b2c2的nova2和novb2之间的序列分别替换为优化的大肠杆菌核糖体结合位点得到的。
11、所述方法制备的套索肽在阻断微生物信号传递中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
12、所述方法制备的套索肽在抑制微生物被膜形成和/或污损发生中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
13、本专利技术还提供一种微生物群体感应抑制剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种套索肽，所述套索肽为如下A1或A2,
2.根据权利要求1所述的套索肽，其特征在于，编码所述套索肽novosphingonodinI的基因簇包括序列1、序列2和序列3所示的核苷酸序列；编码所述套索肽novosphingonodinII的基因簇包括序列7、序列8和序列9所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述套索肽在阻断微生物信号传递和/或抑制微生物的群体感应中的应用。
4.权利要求1或2所述套索肽在抑制微生物被膜形成和/或防止环境污损发生中的应用。
5.权利要求1所述套索肽的制备方法，其特征在于，包括将能够表达所述套索肽novosphingonodinI或者套索肽novosphingonodinII的重组载体导入微生物表达，得到所述套索肽novosphingonodinI或者套索肽novosphingonodinII的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述能够表达套索肽novosphingonodinI的重组载体为含有编码所述套索肽novosphingonodinI的基因簇的载体；所述能够表达套索
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述能够表达套索肽novosphingonodinI的重组载体为所述重组载体pET41a-novA1-RBS-B1C1，所述重组载体pET41a-novA1-RBS-B1C1为将质粒pET41a(+)的NdeI和EcoRI之间的序列替换为编码所述套索肽novosphingonodinI的基因簇，并保持其他序列不变的载体；所述能够表达套索肽novosphingonodinII的重组载体为重组载体pET41a-novA2-RBS-B2C2，所述重组载体pET41a-novA2-RBS-B2C2为将质粒pET41a(+)的NdeI和EcoRI之间的序列替换为编码所述套索肽novosphingonodinII的基因簇，并保持其他序列不变的载体。
8.权利要求5-7任一所述方法制备的套索肽在阻断微生物信号传递中的应用。
9.权利要求5-7任一所述方法制备的套索肽在抑制微生物被膜形成和/或污损发生中的应用。
10.一种微生物群体感应抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分包括权利要求1或2所述套索肽或权利要求5-7任一所述方法制备的套索肽。
...【技术特征摘要】
1.一种套索肽，所述套索肽为如下a1或a2,
2.根据权利要求1所述的套索肽，其特征在于，编码所述套索肽novosphingonodini的基因簇包括序列1、序列2和序列3所示的核苷酸序列；编码所述套索肽novosphingonodinii的基因簇包括序列7、序列8和序列9所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述套索肽在阻断微生物信号传递和/或抑制微生物的群体感应中的应用。
4.权利要求1或2所述套索肽在抑制微生物被膜形成和/或防止环境污损发生中的应用。
5.权利要求1所述套索肽的制备方法，其特征在于，包括将能够表达所述套索肽novosphingonodini或者套索肽novosphingonodinii的重组载体导入微生物表达，得到所述套索肽novosphingonodini或者套索肽novosphingonodinii的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述能够表达套索肽novosphingonodini的重组载体为含有编码所述套索肽novosphingonodini的基因簇的载体；所述能够表达套索肽novosphingonodinii的重组载体为为含有编码所述套索肽novosp...
【专利技术属性】
技术研发人员：周进，蔡中华，曾艳华，程珂珂，赵薇，王涛，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：
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