一种基于一抗原二单抗建立的氟喹诺酮类药物类残留快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于一抗原二单抗建立的氟喹诺酮类药物类残留快速检测方法。本发明专利技术公开了分别抗所述氟喹诺酮类药物诺氟沙星NOR和沙拉沙星SAR的单克隆抗体NOR McAb和SAR McAb，包含所述单克隆抗体NOR McAb和SAR McAb的试剂盒，检测氟喹诺酮类药物的方法，以及所述单克隆抗体NOR McAb和SAR McAb和所述试剂盒在检测氟喹诺酮类药物中的应用。本发明专利技术基于一种包被原(NOR

【技术实现步骤摘要】
一种基于一抗原二单抗建立的氟喹诺酮类药物类残留快速检测方法


[0001]本专利技术属于药物检测领域，具体涉及一种基于一抗原二单抗建立的氟喹诺酮类药物类残留快速检测方法。

技术介绍

[0002]氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones,FQs)是一类人工合成的广谱抗菌药物，已被广泛应用于畜禽、水产等养殖业，主要是通过靶向抑制细菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶IV的合成，阻碍细菌DNA的合成和复制而发挥其杀菌作用。美国已有六种FQs类药物被批准用于动物，包括恩诺沙星，地氟沙星，达诺沙星，马波沙星，奥比沙星和沙拉沙星。我国于20世纪70年代开始将氟喹诺酮类药物(FQs)应用于水产病害防治。
[0003]FQs类药物均具有4
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喹诺酮母核结构，C
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6上连接一氟原子，C
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7位有哌嗪环。从分子结构角度，可以根据N1位置上有无对氟苯基，将FQs分为两大亚类，即有苯环结构的沙拉沙星及二氟沙星，和无苯环结构的诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等。
[0004]由于兽药的不合理使用或滥用造成的氟喹诺酮类药物残留可通过食物链直接危害人体健康，产生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道不良反应和眼部毒性，还具有致癌、致畸、致突变的风险，诱导人类致病菌产生耐药性，引起交叉耐药，影响临床用药和新药开发，造成环境污染等。全球多个国家和地区都非常重视动物源性食品中喹诺酮类药物残留的检测与监控，并颁布了相关的规定予以禁用或设立最大残留限量(MRLs)。我国于2002年规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种喹诺酮类药物在动物肌肉组织中的MRLs为10～500μg/kg，2015年我国农业部制定的2292号公告发布了在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药的决定。
[0005]近年来，兽药残留检测技术主要包括微生物法、仪器检测法、免疫分析法。微生物法灵敏度低、特异性差；仪器检测法主要是基于色谱、质谱的高效液相色谱法、高效液相
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串联质谱法等仪器分析方法，能够精确地检测到是否含有待检药物且灵敏度较高，但样品前处理复杂、设备昂贵，同时需要专业的人员进行操作，不适合现场大量样品的快速检测；而免疫分析方法的优势在于其高特异性，并且无需长时间的样品前处理，从而可实现样本的快速、简便、高通量检测，广泛适用于大量待测样本的筛查。常用的包括酶联免疫吸附法(Enzyme
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linked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光酶联免疫检测方法(Chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)、放射性免疫法(Radioimmunoassay，RIA)、免疫层析试纸法(Immunochromatography assay，ICS)等。
[0006]其中免疫层析试纸法建立在抗原
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抗体特异性反应和层析技术的基础上，是目前最为常用的现场快速检测(On
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site Testing)技术。以胶体金为标记物的胶体金试纸条(GICA)，由于其相对较低的灵敏度，且无法定量，仅适用于高浓度目标化合物的定性检测。以聚苯乙烯微球包裹的镧系元素离子配合物为标记物的镧系荧光微球免疫层析试纸条(LFM
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ICS)不仅灵敏度更高，还能实现定量检测，具有荧光寿命长、Stocks位移大等优点，该
方法现已广泛用于药物残留检测。
[0007]此外，现有技术中氟喹诺酮类药物检测的方法无法兼顾有苯环结构和无苯环结构两亚类药物。
[0008]因此，为守住食品安全的最后一道防线，有必要开发快速、灵敏、实用的检测技术。

技术实现思路

[0009]为了克服现有技术检测氟喹诺酮类药物操作复杂、灵敏度低，无法兼顾两亚类药物的缺陷，考虑到氟喹诺酮类药物结构的相似性及抗原抗体的交叉反应，本专利技术以一种包被原(NOR
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BSA)和两种单克隆抗体(SAR McAb和NOR McAb)，制定了SAR和NOR混合样本的定量计算规则，依据该规则建立了半定量检测13种氟喹诺酮类药物的ELISA方法和LFM
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ICS方法，为动物源性食品中多种氟喹诺酮类药物残留的同时检测提供了新的思路。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一为：一种抗氟喹诺酮类药物NOR的单克隆抗体NOR McAb，所述单克隆抗体NOR McAb包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述单克隆抗体NOR McAb的重链可变区的HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示和HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，且所述单克隆抗体NOR McAb的轻链可变区的LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0011]在本专利技术的较佳实施方案中，所述单克隆抗体NOR McAb的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，和/或，所述单克隆抗体NOR McAb的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0012]在本专利技术的具体实施方案中，包含所述单克隆抗体NOR McAb的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，和/或，包含所述单克隆抗体NOR McAb的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0013]在本专利技术的更佳实施方案中，所述单克隆抗体NOR McAb的重链恒定区源自鼠源抗体的γ链，和/或，所述单克隆抗体NOR McAb的轻链恒定区源自鼠源抗体的λ链。
[0014]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之二为：一种抗氟喹诺酮类药物SAR的单克隆抗体SAR McAb，所述单克隆抗体SAR McAb包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述单克隆抗体SAR McAb的重链可变区的HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示、HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示和HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，且所述单克隆抗体SAR McAb的轻链可变区的LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示、LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
[0015]在本专利技术的较佳实施方案中，所述单克隆抗体SAR McAb的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和/或，所述单克隆抗体SAR McAb的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
[0016]在本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗氟喹诺酮类药物NOR的单克隆抗体NOR McAb，其特征在于，所述单克隆抗体NOR McAb包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述单克隆抗体NOR McAb的重链可变区的HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示和HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，且所述单克隆抗体NOR McAb的轻链可变区的LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；较佳地，所述单克隆抗体NOR McAb的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，和/或，所述单克隆抗体NOR McAb的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；更佳地，所述单克隆抗体NOR McAb的重链恒定区源自鼠源抗体的γ链，和/或，所述单克隆抗体NOR McAb的轻链恒定区源自鼠源抗体的λ链。2.一种抗氟喹诺酮类药物SAR的单克隆抗体SAR McAb，其特征在于，所述单克隆抗体SAR McAb包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述单克隆抗体SAR McAb的重链可变区的HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示、HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示和HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，且所述单克隆抗体SAR McAb的轻链可变区的LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示、LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；较佳地，所述单克隆抗体SAR McAb的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和/或，所述单克隆抗体SAR McAb的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；更佳地，所述单克隆抗体SAR McAb的重链恒定区源自鼠源抗体的γ链，和/或，所述单克隆抗体SAR McAb的轻链恒定区源自鼠源抗体的λ链。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的单克隆抗体NOR McAb或如权利要求2所述的单克隆抗体SAR McAb；优选地，编码所述单克隆抗体NOR McAb的重链可变区的所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示，和/或，编码所述单克隆抗体NOR McAb的轻链可变区的所述核酸的序列如SEQ ID NO:2所示；或，编码所述单克隆抗体SAR McAb的重链可变区的所述核酸的序列如SEQ ID NO:13所示，和/或，编码所述单克隆抗体SAR McAb的轻链可变区的所述核酸的序列如SEQ ID NO:14所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的核酸。5.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求3所述的核酸，或如权利要求4所述的重组表达载体，所述转化体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。6.一种检测氟喹诺酮类药物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含第一抗体，所述第一抗体为如权利要求1所述的单克隆抗体NOR McAb和/或如权利要求2所述的单克隆抗体SAR McAb。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含包被原，所述包被原为半抗原NOR与载体蛋白偶联制成的完全抗原；和/或，所述试剂盒还包含第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合所述第一抗体；较佳地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白；
更佳地，所述包被原为NOR
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BSA，所述NOR
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BSA为所述半抗原NOR的哌嗪环的氮原子上连接一个氨乙基，并偶联所述牛血清白蛋白。8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体用酶标记，所述试剂盒还包含ELISA包被液、ELISA封闭液、ELISA底物显色液和/或ELISA终止液，所述ELISA底物显色液包含体积比为1:1的ELISA底物显色A液和ELISA底物显色B液；较佳地，所述第二抗体用辣根过氧化物酶标记优选为羊抗鼠IgG
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HRP，和/或所述第二抗体的母液浓度为0.8mg/mL～1.2mg/mL，稀释比为1:18000～1:22000，所述稀释比为所述母液与含FBS的1
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PBST的体积比，和/或所述ELISA包被液为pH为9.4～9.8浓度为0.04mol/L～0.06mol/L的碳酸盐缓冲液，和/或所述ELISA封闭液为质量百分比为0.8％～1.2％的明胶，和/或所述ELISA底物显色A液包含25g/L～30g/L乙酸钠、3.0g/L～3.5g/L柠檬酸和0.5mL/L～0.7mL/L 30％H2O2，和/或所述ELISA底物显色B液包含0.25g/L～0.35g/L TMB、0.3g/L～0.5g/L EDTA
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2Na、1.8g/L～2.0g/L柠檬酸和90mL/L～110mL/L甘油，和/或所述ELISA终止液为1.8mol/L～2.2mol/L硫酸。9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述包被原的浓度为0.25μg/mL～0.10μg/mL；和/或，所述NOR McAb或所述SAR McAb的抗体母液浓度为5.0mg/mL～8.0mg/mL，所述SAR McAb的抗体稀释比为1:800000～1:1200000，和/或所述NOR McAb的抗体稀释比为1:6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王权，蒋蔚，杨晨，王小妹，林雅娟，张曼玉，李瑞芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：