本发明专利技术属于动物疫苗制备技术领域。具体涉及H9N2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用。所述的疫苗株是由禽流感分离株通过人工诱变筛选得到。该疫苗株被命名为H9N2亚型禽流感病毒W1‐HA358毒株，其原始分离株为A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2))株。对该分离株的HA基因非编码区3'端的3,5,8位点进行了人工定点突变，利用反向遗传操作拯救出突变株，突变株在MDCK细胞上传代至稳定后得到高增殖滴度的毒株，得到H9N2亚型禽流感病毒细胞苗。本发明专利技术解决了H9N2禽流感病毒在MDCK细胞上增殖不稳定问题，克服了禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题，提高了疫苗的制备效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疫苗制备
具体涉及一株H9N2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用。
技术介绍
H9N2亚型禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒感染家禽后引起一种传染性综合征，在世界范围内广泛传播，严重威胁着畜牧业的发展。1966年首次从火鸡中检测H9N2亚型AIV，此后，AIV在禽类中广泛传播流行。1994年，我国首次报道从广东某鸡场中分离到H9N2亚型AIV，而此后H9N2亚型AIV一直在我国的养禽地区广泛传播。H9N2亚型AIV虽然属于低致病性AIV，但是现在研究表明它还可以感染小鼠，雪貂和人类。除此之外，可以引起禽产蛋率下降、造成免疫抑制、以及激发其他病毒或细菌的混合或继发感染，给我国的养禽业造成严重的经济损失。而且H5N1流感病毒的内部基因都有可能构成H9N2的内部基因，这引起了人们对H9N2禽流感病毒的高度重视。1999年，在中国香港发生了人感染H9N2亚型AIV事件。再到2009年12月，香港第7次在人身上检测出H9N2AIV。这表明，H9N2AIV可以从禽类到哺乳动物跨越物种障碍进行传播，从而扩大了宿主范围。2013年，中国发生了H7N9禽流感病毒感染人事件，导致134人感染和45人死亡。到2014年2月23日为止，总共有213人感染66人死亡。根据禽流感病毒基因组比对和亲缘分析显示，H7N9病毒的6个基因片段来源于H9N2AIV。这表明，H9N2有可能成为将来流行的一种病毒，应该引起高度的重视。因此，为了人类健康和畜牧经济的健康发展，必须加强对H9N2亚型AIV的防控。接种疫苗，是预防禽流感发生与传播最有效的手段。从1878年流感爆发到现在，鸡胚灭活疫苗一直是预防禽流感发生的重要的疫苗之一。目前，我国使用的H9N2亚型AIV疫苗均为鸡胚尿囊液灭活疫苗。鸡胚是禽流感疫苗生产和研究的主要材料。虽然鸡胚灭活苗具有方便运输，制备工艺简单，安全稳定等优点，但是鸡胚培养流感病毒也存在如下许多弊端:(一)在流感大规模爆发的时候，在短期内收集9-10日龄鸡胚甚是困难。(二)用鸡胚培养流感病毒，容易产生大量废弃的鸡胚及其病毒的残留，排放到自然中对环境危害很大。(三)受到母源抗体的影响；(四)生产成本高、周期性长等缺点。为了克服禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题及生产周期长的缺点，通过利用反向遗传操作技术，改造病毒内部基因，提高H9N2禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖滴度。用细胞培养AIV的方法取代用鸡胚生产AIV疫苗的方法，改变传统的方法，完善H9N2亚型禽流感疫苗灭活疫苗生产方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现在使用鸡胚培养禽流感病毒的传统方法，获得一种在细胞上稳定增殖且具有高病毒滴度的细胞疫苗。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的H9N2禽流感细胞疫苗的疫苗株的原始分离株H9N2禽流感病毒株A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)是申请人2004年在湖北某鸡场分离得到【参见：Xiao‐JuanXu,Gao‐YuanXu,Hong‐BoZhou,Zheng‐JunYu.EvolutionarycharacterizationofinfluenzavirusA/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)isolatedfromcentralChinaVirusGenes.2008Feb；36(1):79‐83.Epub2007Nov20】；将A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)中的8个内部基因片段(其核酸序列已被收录在NCBI中)，分别克隆至转录/表达载体pWH2000上(美国St.Jude儿童研究医院Webster博士惠赠)，构建得到8个质粒。构建W1毒株的内部基因的载体分别命名为PWH2000-PB2、PWH2000-PB1、PWH2000-PA、PWH2000-NP、PWH2000-NA、PWH2000-HA、PWH2000-M、PWH2000-NS，将其中命名为PWH2000-HA质粒3,5,8位点的碱基进行人工突变(突变方向为：G3→A3,U5→C5和C8→U8)，构建得到一个突变质粒，然后利用反向遗传操作技术，将该突变质粒和其余7个内部流感基因片段，将W1其余7个构建好的质粒和突变质粒共转染293T+MDCK混合细胞，拯救得到H9N2禽流感病毒突变株W1-HA358，将所述的H9N2禽流感病突变毒株W1-HA358在MDCK细胞上传代，获得高增值滴度并稳定细胞适应的毒株，将其灭活后作为油乳灭活苗检测其免疫原性，证明构建所得的疫苗株具有良好的免疫原性。申请人将该细胞适应毒株命名为H9N2亚型禽流感病毒W1‐HA358毒株，于2015年6月11日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：V201522。与现有技术相比，本专利技术的优点是；(1)本专利技术利用禽流感病毒H9N2作为背景，将HA基因的3'端的3、5、8位点的碱基进行人工突变，然后拯救并得到突变毒株。该突变毒株在MDCK细胞上具有更好的适应性，提高了病毒滴度。(2)本专利技术制备的突变毒株在MDCK细胞上传代获得高增殖滴度的细胞适应毒株，有利于缓解禽流感爆发时亟需大量鸡胚以及鸡胚短缺问题。更详细的技术方案参考见《具体实施方案》所示。附图说明序列表SEQIDNO：1是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因HA的DNA序列，序列长度为1472bp。序列表SEQIDNO：2是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因NA的DNA序列，序列长度为1457bp。序列表SEQIDNO：3是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因M基因的DNA序列，序列长度为1027bp。序列表SEQIDNO：4是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因NP的DNA序列，序列长度为1565bp。序列表SEQIDNO：5是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因NS基因的DNA序列，序列长度为890bp。序列表SEQIDNO：6是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因PA的DNA序列，序列长度为2233bp。序列表SEQIDNO：7是H9N2禽流感分离株A/ch本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株人工突变的具有免疫原性的H9N2亚型禽流感病毒突变株W1‐HA358，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO：V201522。
【技术特征摘要】
1.一株人工突变的具有免疫原性的H9N2亚型禽流感病毒突变株W1‐HA358，保藏在中国
典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCCNO：V201522。
2.权利要求1所述的一株人工突变的具有免疫原性的H9N2亚型...
【专利技术属性】
技术研发人员：周红波，金梅林，白绕仙，王玉刚，李国利，康超，阳姹，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。