重组修饰的安卡拉痘苗病毒及其应用、质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒及其应用，质粒载体及其应用。所述重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒包含插入所述MVA基因组的基因间区(IGR)内的异源DNA序列，其中，所述的IGR的两侧是该MVA基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)，并且其中所述ORF对应于脊椎动物痘病毒中的保守基因。

Ankara modified vaccinia virus recombinant plasmid vector and its application, and its application

The present invention relates to recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) and its application, plasmid vector and its application. The recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) is inserted into the MVA genome contains the intergenic region (IGR) sequence in heterologous DNA, wherein, both sides of the IGR are two adjacent open reading frame of the MVA genome (ORF), and wherein the ORF corresponding to the spine animal pox virus the conserved gene.

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2007年8月24日，申请号为201310054907.1，专利技术名称为《修饰的安卡拉痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点》的中国专利申请的分案申请，申请号为201310054907.1的该分案申请是申请日为2007年8月24日，申请号为200780035385.3，专利技术名称为《修饰的安卡拉(MVA)痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点》的中国专利申请的分案申请。相关申请本申请要求保护2006年8月25日提交的美国临时申请号60/840,093和2006年8月28日提交的美国临时申请号601840,755的权益，所述两份文献因而公开地在此处通过引用的方式完整并入。
本专利技术涉及用于稳定整合外源DNA序列至MVA基因组内的插入位点。相关技术的描述痘病毒科的成员具有编码数百种蛋白质的庞大双链DNA基因组(《费氏病毒学,第五版》Moss,B.2007“痘病毒科：病毒及其复制”(\Poxviridae:The Viruses and Their Replication\in Fields Virology,5th Ed)(D.M.Knipe,P.M.Howley,D.E.Griffin,R.A.1Lamb,M.A.Martin,B.Roizman和S.E.Straus,Eds),LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA)。已知高度减毒的痘苗病毒株-修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因组序列(Sutter,G.和Moss,B.1992美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)89:10847-10851；和Sutter,G.等1994疫苗(Vaccine)12:1032-1040)，其中所述的修饰的安卡拉痘苗病毒不能生长在大多数哺乳动物细胞中并且是重组疫苗载体的良好候选物。修饰的安卡拉痘苗病毒已经在鸡胚成纤维细胞中传代超过570次，在此期间相对于宿主范围严格限制的亲代野生型Ankara株而言，6个重大缺失已经出现(Meyer,H.等1991普通病毒学杂志(J Gen Virol)72:1031-1038)。专利技术简述本专利技术涉及用于整合外源序列至痘苗病毒基因组的基因间区(IGR)内的新插入位点，其中所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或者所述IGR的两侧是该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框，并且其中所述ORF对应于保守基因，并涉及用来插入外源DNA至痘苗病基因组内的相关质粒载体，并且还涉及作为药物或疫苗的含有插入所述新插入位点内的外源序列的重组痘苗病毒。附图说明图1.基于pol基因序列同一性的HIV-1和HIV-2的系统发生学关系。SIVcpz和SIVsmm是分别从黑猩猩(chimpanzee)和白眉猴(sooty mangabey monkey)中回收的类人灵长类慢病毒。图2.基于全长pol基因序列的具有四种不同SIVcpz分离株的HIV-1M组、N组和O组(group)的系统发生学关系。短棒表示遗传距离0.1(10％核苷酸趋异性)并且星号指出基于env序列的N组HIV-1分离株的位置。图3.HIV-1分离株的嗜性及生物学特征。图4.HIV-编码的蛋白质。显示HIV基因的位置、初级翻译产物(在一些情况下是多聚蛋白)的尺寸和加工的成熟病毒蛋白。图5.成熟HIV-1病毒粒子的示意图。图6.HIV-1Env糖蛋白的线性示意图。箭头1表示gp160切割成gp120和gp41的位点。在gp120中，交叉线区域代表可变结构域(V1-V5)并且空心框描述保守序列(C1-C5)。在gp41胞外结构域中，显示几个结构域：氨基端融合肽和两个胞外结构域螺旋(氨基端螺旋与羧基端螺旋)。跨膜结构域由黑色框代表。在gp41胞浆结构域中，显示Tyr-X-X-Leu(YXXL)内吞基序(SEQ ID NO:1)和两个预测性螺旋结构域(螺旋-l和螺旋-2)。氨基酸编号被标出。图7.pLW-73转移载体。图8.pLW-73转移载体的核苷酸序列(上部链，SEQ IDNO:2；底部链，SEQ ID NO:3)。图9.编码乌干达进化枝D Env蛋白(分离株A07412)的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。图10.编码乌干达进化枝D gagpol蛋白(分离株A03349)的密码子变异的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。图11.重组MVA的生成和对所插入基因的稳定性的分析。A)将env和gagpol分别插入Del II和Del III位点的示意图例。B)通过免疫染色法评价稳定性。图12.MVA/65A/G env中env突变的类型和频率。图13.在Del III中插入Env in I8R/G1L IGR和Gag Pol。图14.修饰A/G构建体以增加稳定性。图15.蚀斑传代后的Env的表达。图16.各个克隆的PCR和蛋白质印迹分析。图17.通过双重重组MVA(double recombinant MVA)表达A/G env。图18.表达来自乌干达HN-1分离株的env和gagpol的重组病毒。图19.MVA/UGD4a-无着色env蚀斑的分析。图20.对重组MVA中UGD env基因的修饰图21.MVA/UGD4b-无着色gag蚀斑的分析。*，成段4-6个G或C残基的位置。图22.对重组MVA中UGD gagpol基因的修饰。图23.构建表达UGD env和gagpol的稳定重组MVA。图24.由MVA/UGD4d激发的细胞应答。图25.由MVA/UGD4d激发的抗体应答。微生物的保藏以下微生物已经根据布达佩斯条约条款以所示日期保藏于弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC):微生物登录号日期MVA1974/NIH克隆1PTA-50952003年3月27日MVA1974/NIH克隆1以ATCC登录号：PTA-5095在2003年3月27日保藏于美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，Blvd大学，10801，美国典型培养物保藏中心(ATCC)。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的条款进行该保藏。这确保自保藏日起维持此保藏的活培养物30年。ATCC将根据布达佩斯条约的条款使该保藏物可获得并且该保藏物遵循申请人与ATCC之间合同，其中所述的合同确保在相关的美国专利发布时或在任何美国申请或外国申请的公众公开时，无论谁在先，公众可永久且不受限制地获得该保藏物的培养物的子代，并且确保美国专利商标局委员会根据35USC§122得到授权并且根据其委员会规定(包括37CFR§1.14)决定的个人可获得所述子代。所保藏毒株的可获得性不得解释为与任何政府权利机关根据其专利法所授予的权力相抵触地许可实施本专利技术。优选实施方案详述除非另外定义，本文中所用技术术语和科学术语具有如本专利技术所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。参见例如，Singleton P和Sainsbury D.,微生物学与分子生物学词典第三版(Dictionaryof Microbiology and MolecularBiology.3rd ed.),J.Wiley&本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含插入所述MVA基因组的基因间区(IGR)内的异源DNA序列，其中，所述IGR的两侧是该MVA基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)，并且其中所述ORF对应于脊椎动物痘病毒中的保守基因，并且其中所述相邻ORF不选自由根据Genbank登录号M35027的E8R‑E9L、I5L‑I6L、G7L‑G8R、G8R‑G9R、L1R‑L2R、L2R‑L3L、L3L‑L4R、J4R‑J5L、J5L‑J6R、H2R‑H3L、H4L‑H5R、H6R‑H7R、H7R‑D1R、D4R‑D5R、D6R‑D7R、D10R‑D11L、D11L‑D12L、D12L‑D13L、D13L‑A1L、A3L‑A4L、A4L‑A5R、A6L‑A7L、A7L‑A8R、A11R‑A12L、A12L‑A13L、A13L‑A14L、A22R‑A23R和A23R‑A24R所组成的组。

【技术特征摘要】
2006.08.25 US 60/840,093;2006.08.28 US 60/840,7551.重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含插入所述MVA基因组的基因间区(IGR)内的异源DNA序列，其中，所述IGR的两侧是该MVA基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)，并且其中所述ORF对应于脊椎动物痘病毒中的保守基因，并且其中所述相邻ORF不选自由根据Genbank登录号M35027的E8R-E9L、I5L-I6L、G7L-G8R、G8R-G9R、L1R-L2R、L2R-L3L、L3L-L4R、J4R-J5L、J5L-J6R、H2R-H3L、H4L-H5R、H6R-H7R、H7R-D1R、D4R-D5R、D6R-D7R、D10R-D11L、D11L-D12L、D12L-D13L、D13L-A1L、A3L-A4L、A4L-A5R、A6L-A7L、A7L-A8R、A11R-A12L、A12L-A13L、A13L-A14L、A22R-A23R和A23R-A24R所组成的组。2.根据权利要求1所述的重组MVA，其中，所述两个相邻ORF选自由以下所组成的组：a)两个相邻ORF选自由根据Genbank登录号M35027的F12L-F13L、F17R-E1L、E1L-E2L、E9L-E10R、I1L-I2L、I2L-I3L、I6L-I7L、I7L-I8R、G1L-G3L、G3L-G2R、G2R-G4L、G4L-G5R、G6R-G7L、G9R-L1R、L4R-L5R、L5R-J1R、J3R-J4R、J6R-H1L、H1L-H2R、H3L-H4L、H5R-H6R、D1R-D2L、D2L-D3R、D3R-D4R、D5R-D6R、D9R-D10R、A1L-A2L、A5R-A6L、A8R-A9L、A9L-A10L、A10L-A11R、A14L-A14.5L、A14.5L-A15L、A15L-A16L、A16L-A17L、A17L-A18R、A18R-A19L、A19L-A21L、A21L-A20R、A20R-A22R、A28L-A29L和A29L-A30L所组成的组，b)两个相邻ORF选自由根据痘苗西储GenBank登录号NC_006998的G5R-G5.5R、G5.5R-G6R、A14L-A14.5L和A14.5L-A15L所组成的组。3.根据权利要求1所述的重组MVA，其中，所述两个相邻ORF选自由根据Genbank登录号M35027的F17R-E1L、G2R-G4L、G6R-G7L、J6R-H1L、D1R-D2L、A5R-A6L、A8R-A9L、A18R-A19L所组成的组。4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组MVA，其中，所述异源D...

【专利技术属性】
技术研发人员：伯纳德·莫斯，琳达·怀亚特，帕特里夏·厄尔，
申请(专利权)人：美国国有健康与人类服务部马里兰州，
类型：发明
国别省市：美国;US