一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生命科学与生物技术领域，涉及一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括引物、探针、及PCR试剂，所述引物及探针包括：(1)序列如SEQ ID NO：1‑3所示的检测H5亚型禽流感病毒的引物及探针：(2)序列如SEQ ID NO：4‑6所示的检测新城疫强毒的引物及探针。本发明专利技术所太守的试剂盒适用于H5亚型禽流感病毒和新城疫强毒的定量检测和流行病学实时监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生命科学与生物
，涉及一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR的试剂盒。适用于H5亚型禽流感病毒和新城疫强毒的定量检测和流行病学实时监测。
技术介绍
流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分节段基因组的单股负链RNA病毒。流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒抗原变异性最强，感染人和动物，常引起世界性大流行，多种禽类均可感染(YoonSW,WebbyRJ,WebsterRG:EvolutionandEcologyofInfluenzaAViruses.MicrobiologicalReviews1992,56(1):152-179.)。根据其包膜表面血凝素(Hemagglutinin)和神经氨酸酶(Neuraminidase)的抗原性分为若干亚型。其中H5N1亚型禽流感病毒自1996年分离以来，呈世界流行并给养禽业造成巨大经济损失，给人类公共卫生构成了巨大威胁。2014年以来我国H5N1亚型禽流感病毒以clade2.3.2.1c、clade2.3.4.4和clade7.2为流行分支(GuM,LiuW,CaoY,PengD,WangX,WanH,ZhaoG,XuQ,ZhangW,SongQ:Novelreassortanthighlypathogenicavianinfluenza(H5N5)virusesindomesticducks,China.EmergingInfectiousDiseases2011,17(6):1060-1063.)。截至2016年5月，经实验室确认的人感染H5N1病毒的病例已达到850例，其中449例死亡(WHO,CumulativenumberofconfirmedhumancasesforavianinfluenzaA(H5N1)reportedtoWHO,http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/.)。因此防控H5亚型禽流感病毒有重要的公共卫生意义。同H5亚型禽流感一样，新城疫(NewcastleDisease,ND)强毒也是严重危害禽类的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染家禽，发病率和死亡率都很高。新城疫是由新城疫病毒(NewcastleDiseasevirus,NDV)引起的一种烈性传染病，被OIE列为必须通报的重要疫病，在至少六个大洲都有分布(RajmaniRS,SinghPK,RaviKumarG,SaxenaS,SinghLV,KumarR,SahooAP,GuptaSK,ChaturvediU,TiwariAK:In-vitrocharacterizationandevaluationofapoptoticpotentialofbicistronicplasmidencodingHNgeneofNewcastlediseasevirusandhumanTNF-alpha.Animalbiotechnology2015,26(2):112-119.)。新城疫对200多种禽类和其他动物都有感染能力，是危害世界禽类养殖业的重要疾病之一。NDVClassII病毒宿主范围广，临床样品来源多元化，ClassII分支中III-X亚型均为强毒。H5亚型与新城疫强毒的发生均可导致禽类出现呼吸系统疾病症状，在临床症状和病理变化等方面有许多相似处，给临床鉴别诊断带来较大的困难。当这两种病毒混合感染禽类时，使用传统的病原分离及血清学方法时诊断操作繁琐，往往需要数天完成，且无法实现对两病的同步检测。现在虽有学者建立多重PCR方法同时检测H5禽流感病毒和新城疫强毒，但仅依赖普通凝胶电泳还达不到高通量集成化诊断的层次，因而需要研究一种能够对两种病毒进行高通量快速排查、准确鉴别的集成化诊断技术。有效防控H5禽流感和新城疫强毒，关键在于早期快速、敏感和特异的鉴别诊断，本专利技术根据两种病毒特有的保守基因序列，设计引物然后利用荧光定量PCR技术进行检测，一次可以同时分析数十个样本，从而达到快速高通量检测H5禽流感和新城疫强毒的目的。多数现有的检测流感病毒和新城疫病毒的分子诊断技术采用二步法，包括随机引物介导的反转录(第一步)和随后特异性引物的PCR(第二步)。二步法使用随机引物，会产生大量的背景核酸，降低反转录的效率，而且产生的背景核酸也会降低PCR的效率。一步法是基于特异引物的反转录体系，效率高，易操作，减低污染，从而大大提高了PCR的扩增效率。BHQ1、MGB基团是新一代猝灭基团，本身不产生荧光，与TAMARA等传统猝灭基团相比，背景低，灵敏度高。Taqman-MGB探针是在TaqMan探针的3’端偶联结了小沟结合物(Minorgroovebinding,MGB)，它可以缩短探针长度，降低荧光本底，增强探针与模板的结合，并实现分辨一个碱基的差异(SahaR,DonofrioRS,BagleyST:Quantitativereal-timePCRdetectionofPseudomonasoleovoranssubsp.lubricantisusingTaqMan-MGBassayincontaminatedmetalworkingfluids.InternationalBiodeterioration&Biodegradation2011,65(3):460-464)，在检测多种病原方面都有应用。MGB小沟结合物能提高探针Tm值，使探针更短，信号本底更低，还能帮助引物与目标基因结合(MaM,LiuJ,SongY,LiL,LiY:TaqManMGBProbeFluorescenceReal-TimeQuantitativePCRforRapidDetectionofChineseSacbroodVirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。MGB与BHQ1探针3′端的猝灭基团取代传统的TAMRA后自身不发光，荧光本底降低，改善了荧光光谱分辨率(MingxiaoM,JinhuaL,YingjinS,LiL,YongfeiL:TaqManMGBprobefluorescencereal-timequantitativePCRforrapiddetectionofChineseSacbroodvirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。因此本方法有较高的灵敏性、特异性和重复性，在早期快速检测H5亚型禽流感与新城疫强毒方面具有很好的应用价值。我国于2004年颁布H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法的国家标准，于2011年颁布对所有亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法的国家标准。其中H5检测方法可能不能与近年禽流感H5亚型的流行分支的变化情况相适应。本专利技术针对近5年来实验室分离到的H5亚型禽流感病毒的变化情况设计针对HA基因的引物和探针，能够检测clade2.3.4.4,clade2.3.2.1c以及早期clade0等分支的H5禽流感病毒。临床实验表明本方法能够检测泄殖腔棉拭子、组织病料、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒，包括引物、探针、及PCR试剂，其特征在于，所述引物及探针包括：(1)检测H5亚型禽流感病毒的引物及探针：HA‑FP：CTTGCGACTGGGCTCAGAAATHA‑RP:TTTGGGTGGATTCTYTGTCTGCHA‑probe:VIC‑CATTCCYTGCCATCC‑MGB(2)检测新城疫强毒的引物及探针：F‑FP:GGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCF‑RP:AACCCCAAGAGCTACACTGCCF‑probe:FAM‑AAGCGTTTYTGTCTCCTTCCTCC‑BHQ1。

【技术特征摘要】
1.一种联合检测H5亚型禽流感病毒与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒，包括引物、探针、及PCR试剂，其特征在于，所述引物及探针包括：(1)检测H5亚型禽流感病毒的引物及探针：HA-FP：CTTGCGACTGGGCTCAGAAATHA-RP:TTTGGGTGGATTCTYTGTCTGCHA-probe:VIC-CATTCCYTGCCATCC-MGB(2)检测新城疫强毒的引物及探针：F-FP:GGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCF-RP:AACCCCAAGAGCTACACTGCCF-probe:FAM-AAGCGTTTYTGTCTCCTTCCTCC-BHQ1。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成包括：(1)A液：12.5x酶Mix：包括1U/uL的热启动TaqDNA聚合酶、7.5U/uL的RNase抑制剂、95U/uL的反...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，张竹君，吴其文，刘东，孙文强，胡娇，顾敏，刘晓文，胡顺林，王晓泉，刘慧谋，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32