一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用。本发明专利技术提供了一种引物组，包括引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；所述引物对乙由引物F2和引物R2组成；引物F1如序列1所示；引物R1如序列2所示；引物F2如序列3所示；引物R2如序列4所示。所述引物组的用途为如下(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。采用本发明专利技术提供的引物组进行检测，特异性好、敏感性高，只需要4‑5小时的时间即可对临床样品进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，对于北美H3N8亚型犬流感病毒疫病诊断和流行病学调查具有重大的应用价值。

Primer set for detecting H3N8 subtype canine influenza virus in North America and application thereof

The invention discloses a primer set for detecting H3N8 subtype canine influenza virus in North America and its application. The present invention provides a primer set, including primers A and B primers; the primer on nail by primer F1 and primer R1; the primers of ethylene by primer F2 and primer R2; F1 primers as shown in sequence 1; R1 primers as shown in sequence 2 F2 primer sequence; 3 shows; primer R2 as shown in sequence 4. The use of the primer group is to assist the identification of the North American H3N8 subtype canine influenza virus (C1); (C2) to assist in the identification of whether the tested sample contains a North American H3N8 subtype influenza virus. The invention provides a primer set for detection, high sensitivity and specificity, and only 4 5 hour were detected in clinical samples, simple operation, easy to promote, facilitate the basic operation and application, has important application value for the investigation of America H3N8 canine influenza virus disease diagnosis and epidemiology.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用。
技术介绍
近年来，甲型流感病毒感染犬的报道不断出现，包括H3N8亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H5N1亚型流感病毒和H1N1亚型流感病毒，美国、英国、澳大利亚等国家均有H3N8亚型犬流感病毒疫情的报道。H3N8亚型犬流感病毒能够在犬中有效传播，引起发热、咳嗽、流鼻涕等流感样症状，严重的引起犬出血性肺炎并导致死亡。目前，中国尚未有犬感染北美H3N8亚型犬流感病毒的报道。随着近几年宠物市场扩展，以及各国警犬、军犬引种工作的日益频繁，这增加了北美H3N8亚型犬流感病毒传入中国的可能，因此，需要建立一种针对北美H3N8亚型犬流感病毒的快速检测方法。现有北美H3N8亚型犬流感病毒的鉴定方法为血凝抑制试验。血凝抑制试验涉及到病原的分离，操作相对繁琐，且各亚型之间容易相互影响，敏感性较低，耗时耗力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用。本专利技术首先提供了一种引物组，包括引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；所述引物对乙由引物F2和引物R2组成。所述引物F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。所述引物F2为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。本专利技术还保护一种特异引物对，为所述引物对甲或所述引物对乙。所述引物组或所述特异引物对的用途为如下(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。本专利技术还保护所述引物组或所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述引物组或所述特异引物对；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。所述试剂盒还包括标准品质粒。具体来说，所述试剂盒包括标准品质粒甲和/或标准品质粒乙。所述标准品质粒甲为具有序列表的序列5所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒甲为具有序列表的序列5第376-465位核苷酸所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒甲为将序列表的序列5所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述标准品质粒甲为将序列表的序列5第376-465位核苷酸所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述标准品质粒乙为具有序列表的序列6所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒乙为具有序列表的序列6第868-1012位核苷酸所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒乙为将序列表的序列6所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述标准品质粒乙为将序列表的序列6第868-1012位核苷酸所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。本专利技术还保护用于检测DNA分子甲的物质和用于检测DNA分子乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述DNA分子甲为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对甲的靶序列；所述DNA分子乙为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对乙的靶序列；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。本专利技术还保护用于检测DNA分子甲的物质或用于检测DNA分子乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述DNA分子甲为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对甲的靶序列；所述DNA分子乙为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对乙的靶序列；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。所述DNA分子甲具体如序列表的序列5第376-465位核苷酸所示。所述DNA分子乙具体如序列6第868-1012位核苷酸所示。本专利技术还保护一种辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，分别采用所述引物对甲和所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果均显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不满足上述条件、待测病毒为候选的非北美H3N8亚型犬流感病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，分别采用所述引物对甲和所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果均显示阳性扩增曲线、待测样本疑似含有北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不满足上述条件、待测样本疑似不含有北美H3N8亚型犬流感病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的非北美H3N8亚型犬流感病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果显示阳性扩增曲线、待测样本疑似含有北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不显示阳性扩增曲线、待测样本疑似不含有北美H3N8亚型犬流感病毒。以上任一所述方法中，采用所述引物对甲时，荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min；95℃15s、59℃1min，40个循环。以上任一所述方法中，采用所述引物对乙时，荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min；95℃15s、58℃1min，40个循环。以上任一所述方法中，采用所述引物对甲时，荧光定量PCR的反应体系为：SYBRPremixExTaq(2X)10μL、引物F10.5μL、引物R10.5μL、模板2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F1和引物R1在反应体系中的浓度均为0.5μM。以上任一所述方法中，采用所述引物对乙时，荧光定量PCR的反应体系为：SYBRPremixExTaq(2X)10μL、引物F20.5μL、引物R20.5μL、cDNA2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F2和引物R2在反应体系中的浓度均为0.5μM。以上任一所述方法中，荧光定量PCR采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组，包括引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；所述引物对乙由引物F2和引物R2组成；所述引物F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物F2为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.引物组，包括引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；所述引物对乙由引物F2和引物R2组成；所述引物F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物F2为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。2.一种特异引物对，为权利要求1中的所述引物对甲或权利要求1中的所述引物对乙。3.权利要求1所述引物组或权利要求2所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。4.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组或权利要求2所述特异引物对；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。5.用于检测DNA分子甲的物质和用于检测DNA分子乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述DNA分子甲为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中引物对甲的靶序列；所述DNA分子乙为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中引物对乙的靶序列；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒；所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；所述引物F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物对乙由引物F2和引物R2组成；所述引物F2为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒲娟，宋晶伟，孙洪磊，王晨曦，张谞霄，刘金华，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11