本发明专利技术公开了一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法，所述的耐热疫苗株分类命名为rTS‑HA/H9‑IL6，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201630。该疫苗株该毒株在感染动物或细胞后，可高效表达H9亚型禽流感病毒的全长HA蛋白和鸡白介素6蛋白。该毒株可用于制备H9禽流感、新城疫二联耐热活疫苗，鸡白介素6蛋白起到了免疫增强剂的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
技术介绍
H9亚型禽流感是危害我国养禽业的一个重要的禽流感病毒亚型，属低致病性禽流感。由于其致病力较低，不直接引发禽群的大量死亡而易被人们所忽视。但该亚型禽流感病毒可破坏鸡群的免疫系统，严重时可导致免疫抑制，继而引发大肠杆菌等其它病原的感染，从而造成较高的死亡率，感染H9亚型禽流感病毒的产蛋鸡死亡率约为10％，产蛋率下降20％左右，造成较大的经济损失。预防接种灭活疫苗是我国当前防控H9亚型禽流感的主要手段。传统的灭活疫苗制备比较简单，储存运输方便，免疫效果持久，在禽流感防控中发挥了重要作用。但灭活疫苗也有一些不足之处，如需肌肉注射，费工费时，免疫成本高。灭活疫苗的使用在一定程度上增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。因此，研发廉价、安全、高效的H9亚型禽流感疫苗具有重要的现实意义。随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫苗的研发不断取得突破，其中基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗是研发热点之一，许多病原的免疫原性基因已经在新城疫载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、H5亚型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、严重急性呼吸综合征病毒的CoV蛋白、人类免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫(体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫)、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便(饮水、气雾、点眼/滴鼻等方式)、安全(毒株间发生重组及毒力返强可能性极小)等优点。但现有的新城疫病毒载体疫苗均是以非耐热型新城疫病毒为骨架构建的。研究表明，一些禽类细胞因子具有佐剂性质。白细胞介素6(IL-6)是一种多功能细胞因子，它在调节机体免疫应答、急性期反应和造血等方面起着重要作用。共表达IL-6和HIV 1B亚型代表株的gp120蛋白的表达质粒pGPIL-6，免疫小鼠后发现该质粒能够刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，并可显著提高机体CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量，表明细胞因子IL-6很好的发挥了免疫佐剂的效应。将鸡重组白介素-6蛋白(rChIL-6)与鸡传染性支气管炎病毒(IBDV)灭活疫苗免疫雏鸡后，发现rChIL-6可上调细胞因子鸡白细胞介素4(ChIL-4)表现有已经上市的H9禽流感、新城疫二联疫苗均是将H9亚型禽流感病毒株和新城疫病毒株灭活后制备而成的，其主要原因是由于H9亚型禽流感病毒具有一定的致病性，不能用于制备活疫苗。此类疫苗的缺点是需肌肉注射，费工费时，免疫成本高。灭活疫苗的使用在一定程度上增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。专利申请号为“CN200810222776.2”的文献公开了表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株。该疫苗株不具备显著的耐热特性，且未加入免疫增强因子。因此，如何提供一种具有耐热、稳定性强、冷藏条件要求低的共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术进行了深入研究，提供了一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。本专利技术一方面涉及一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-HA/H9-IL6，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201630。本专利技术另一方面还涉及共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1.1 HA/H9基因的插入将H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接种5天后收获鸡胚尿囊液；将收获的尿囊液进行HA基因的RT-PCR扩增，扩增引物为：上游引物5′-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3′，下游引物5′-ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTATATACAAATGTTGCATCTGC-3′；对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。1.2 新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5′-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3′，下游引物5′-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGCGATC-3′；扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C；对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接；1.3 重组质粒pTS-HA/H9的连接与鉴定采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA基因片段和耐热载体片段进行克隆连接(连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT)。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养；对菌液进行HA基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液进行质粒提取进行酶切鉴定；14 IL6基因的PCR扩增以质粒pIL6为模板，进行IL6基因的PCR扩增，扩增引物为：上游引物5′-ACAGGGCCAAAGAAATTAGAAAAAAGTACGGGTAGAAAGCAGCTTGCCACCATGAACTTCACCGAGGGCTGCGA-3′，下游引物5′-CTCTGAATGTCTCCCTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGGCACTGAAACTCCTGGTC-3；对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；1.5 新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5′-GGGAGACATTCAGAGATCAGGGCGAGTCACCCGGGT-3′，下游引物5′-TTTCTTTGGCCCTGTATTGATTATTAGTGGGTCGC-3′，扩增模板为中间质粒pTS-HA/H9，对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接；1.6 重组质粒pTS-HA/H9-IL6的连接与鉴定采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的IL6基因片段和耐热载体片段进行克隆连接(连接序列为ACAGGGCCAAAGAAA和GGGAGACATTCAGAG)；连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养；对菌液进行IL6基因的PCR鉴定；鉴定为阳性的菌液进行质粒提取进行酶切鉴定；1.7 重组病毒rTS-HA/H9-IL6的拯救恢复采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-HA/H9-IL6与三个分别表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞；转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄S本文档来自技高网...
【技术保护点】
共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS‑HA/H9‑IL6，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201630。
【技术特征摘要】
1.共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-HA/H9-IL6，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201630。2.共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1.1 HA/H9基因的插入将H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接种5天后收获鸡胚尿囊液；将收获的尿囊液进行HA基因的RT-PCR扩增，扩增引物为：上游引物5′-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3′，下游引物5′-ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTATATACAAATGTTGCATCTGC-3′；对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5′-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3′，下游引物5′-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGCGATC-3′；扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C；对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接；1.3重组质粒pTS-HA/H9的连接与鉴定采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA基因片段和耐热载体片段进行克隆连接，连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT；连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养；对菌液进行HA基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液进行质粒提取进行酶切鉴定；14 IL6基因的PCR扩增以质粒pIL6为模板，进行IL6基因的...
【专利技术属性】
技术研发人员：温国元，邵华斌，罗玲，胡潇，罗青平，王红琳，张腾飞，汪宏才，张蓉蓉，卢琴，艾地云，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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