【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于禽沙门菌病防治，具体涉及一种稳定表达鸡白痢沙门菌标准型o抗原的菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种严重危害世界家禽养殖业的疫病。其主要发病期为2-3周的雏鸡，感染后可引起白痢，导致死亡。成年鸡感染后可导致生长减缓、产蛋能力下降，给养禽业带来极大的经济损失。该病可水平和垂直传播，其中垂直传播是该病的主要传播途径，对种鸡进行鸡白痢净化是控制该病的关键手段。净化依赖高效的检测技术与试剂，因此研制高效、稳定的检测试剂对于鸡白痢净化至关重要。
2、运用鸡白痢凝集抗原，通过全血或血清凝集试验是检测鸡白痢阳性鸡只的主要方法。由于鸡白痢沙门菌o12抗原存在差异，即导致了鸡白痢沙门菌存在标准型和变异型2种血清亚型。鸡白痢沙门菌的标准型菌株的o12抗原包含了o121、o123，而鸡白痢沙门菌的变异型菌株的o12抗原包含了o121、o122，导致其血清的识别能力存在差异。因此，鸡白痢凝集抗原通常由鸡白痢沙门菌标准型菌株和鸡白痢沙门菌变异型菌株组合制备。
3、然而，凝集抗原制备菌株的o抗原并不稳定，其中鸡白痢沙门菌标准型菌株随着传代和培养条件的变化，其后代克隆中存在大量的变异型亚型，即存在o抗原从标准型向变异型的转换。这也导致制备的凝集抗原中标准型抗原组分不可控，抗原稳定性不足，影响检测准确度。
技术实现思路
1、本专利技术在鉴定了鸡白痢沙门菌标准型o抗原向变异型转变的关键酶的基础上，运用基因工程技术构建稳定表达标准型o抗原的鸡白痢
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、稳定表达鸡白痢沙门菌标准型o抗原的菌株，所述的菌株是将鸡白痢沙门菌标准型菌株中的spul_2404基因敲除，spul_2404基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、优选地，通过同源重组的方法敲除spul_2404基因，其方法包括以下步骤：
5、(1)扩增spul_2404基因上下游同源臂；优选地，spul_2404基因上游同源臂的扩增引物序列如seq id no.4和5所示，下游同源臂的扩增引物序列如seq id no.6和7所示；
6、(2)将自杀质粒pre112和所述的spul_2404基因上下游同源臂连接，构建同源重组自杀质粒pre112-δspul_2404；
7、(3)将含有同源重组自杀质粒pre112-δspul_2404的大肠杆菌与鸡白痢沙门菌标准型菌株结合，通过结合转移将所述的同源重组自杀质粒pre112-δspul_2404转化至鸡白痢沙门菌标准型菌株中，筛选获得spul_2404基因缺失菌株。
8、spul_2404基因缺失的鸡白痢沙门菌的o抗原稳定性分析：spul_2404基因缺失菌株与o123血清反应，而不与o122血清反应，表明spul_2404基因缺失菌株为标准型菌株；将spul_2404基因缺失菌株连续传代40代后，挑取单菌落分别与标准型血清o123和变异型血清o122进行反应，结果表明，菌株的100个单菌落亚克隆均只与标准型血清o123反应，表现出良好的标准型o抗原稳定性。
9、spul_2404基因缺失的鸡白痢沙门菌在制备鸡白痢标准型凝集抗原中的应用：将培养好的鸡白痢沙门菌△spul_2404经福尔马林灭活，结晶紫染色，制得稳定的标准型凝集抗原，平板凝集试验显示，以△spul_2404制备的标准型凝集抗原与鸡白痢沙门菌标准型菌株感染的鸡血清具有良好的凝集效果。
10、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
11、目前的鸡白痢凝集抗原由鸡白痢沙门菌标准型菌株和变异型菌株按固定比例组合制备，然而，随着传代和培养条件的变化，鸡白痢沙门菌凝集抗原制备菌株并不稳定，鸡白痢沙门菌标准型菌株的o抗原会向变异型转换，导致由该菌制备的鸡白痢凝集检测抗原组分变化，稳定性不足，影响检测准确度。本专利技术在率先鉴定了鸡白痢沙门菌标准型o抗原向变异型转变的关键酶的基础上，运用基因工程技术，敲除了导致鸡白痢沙门菌o抗原变异的关键酶基因spul_2404，避免标准型菌株的o抗原向变异型转换，获得稳定表达标准型o抗原的鸡白痢沙门菌标准型菌株。因此由该菌株制备的鸡白痢凝集抗原，其标准型o抗原组分稳定可控，可有效提升凝集抗原检测试剂的稳定性。
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1.稳定表达鸡白痢沙门菌标准型O抗原的菌株，其特征在于，所述的菌株是将鸡白痢沙门菌标准型菌株中的SPUL_2404基因敲除，所述SPUL_2404基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，通过同源重组的方法敲除SPUL_2404基因。
3.权利要求1或2所述的菌株在制备鸡白痢沙门菌标准型凝集抗原中的应用。
4.稳定表达鸡白痢沙门菌标准型O抗原的菌株的构建方法，其特征在于，包括利用自杀质粒pRE112构建携带SPUL_2404基因上下游同源臂的同源重组自杀质粒pRE112-ΔSPUL_2404，通过结合转移将所述的同源重组自杀质粒pRE112-ΔSPUL_2404转化至鸡白痢沙门菌标准型菌株中，筛选获得SPUL_2404基因缺失菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，SPUL_2404基因上游同源臂的扩增引物序列如SEQ ID NO.4和5所示，SPUL_2404基因下游同源臂的扩增引物序列如SEQ ID NO.6和7所示。
【技术特征摘要】
1.稳定表达鸡白痢沙门菌标准型o抗原的菌株，其特征在于，所述的菌株是将鸡白痢沙门菌标准型菌株中的spul_2404基因敲除，所述spul_2404基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，通过同源重组的方法敲除spul_2404基因。
3.权利要求1或2所述的菌株在制备鸡白痢沙门菌标准型凝集抗原中的应用。
4.稳定表达鸡白痢沙门菌标准型o抗原的菌株的构建方法，其特征在于，包括利用自杀质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：张腾飞，程伊洛，张文婷，龚建森，罗青平，胡巧，温国元，卢琴，郭云清，姚伦，商雨，汪宏才，张蓉蓉，曾哲，邵华斌，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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