【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于人乳头瘤病毒检测，具体涉及一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂及试剂盒。
技术介绍
1、人类乳头瘤病毒(human papilloma virus，简称：hpv)感染已被认为是全球宫颈癌前病变和侵袭性宫颈癌的主要原因。根据2014年癌症信息中心发布的报告，在中国，hpv最常见的亚型有15种，包括hpv l6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和73。人乳头状瘤病毒的不同基因型具有不同的致病性。虽然有15种类型与hpv感染和宫颈癌的发病机制密切相关，但研究证实，超过50％的宫颈病例是由hpv16感染引起，而10％-15％病例则是由hpv18引起的。此外，研究发现宫颈鳞癌患者中hpv16型是最常见的型别(76.6％)，其次是hpv18型(7.9％)，子宫颈腺癌hpv16/18型的感染率分别为33.65％、28.86％。hpv16/18型与大部分子宫颈癌前病变有关。有团队研究1739例宫颈鳞状细胞患者，在这些患者中hpv16和hpv18的检出比例达到67.74％。它证实了hpv 16和hpv 18是世界上最流行的两种亚型。高危人乳头瘤病毒hpv检测被广泛认为是最敏感的宫颈癌筛查方法，也是最有效的预测方法。
2、hpv检测分为mrna检测和dna检测。dna检测包括普通聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，pcr)反向点杂交法，杂交捕获法，实时荧光定量pcr法等。2014年美国食品药品监督管理局批准了首个单独用于子宫颈癌初筛的
3、近年来，越来越多的新型核酸扩增技术被开发出来，以专门应对在资源有限的环境中进行相对较高灵敏度诊断的挑战。恒温扩增技术是在某一恒定的温度下，利用一种或多种酶，模拟生物体内的扩增，来扩增目标核酸，进而实现体外检测。与传统的pcr检测方法相比，恒温扩增技术减少了对高精度仪器、高水平的技术以及复杂的样本制备等要求，扩增产物通常在37-40℃下只操作20-40分钟内就可以检测完成。为了满足资源有限的地区、场所对低成本宫颈癌筛查的需求，急需我们开发一种可以实现即时检测的宫颈癌筛查产品。
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的至少一种，本专利技术提供了一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂及试剂盒。本专利技术裂解法实现样本快速高效制备，采用恒温反应试剂及扩增反应液，实现目的片段在体外的指数扩增，最后通过试纸条显色法，来实现样本的快速检测。本专利技术不需要昂贵的大型精密仪器设备，操作简单，结果判读可视化，可适用于现场检测。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：
3、本专利技术的第一方面提供了一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，所述恒温反应试剂包括反应冻干粉、扩增反应液、第一稀释液和第二稀释液，所述反应冻干粉组分包括引物重组蛋白、结合蛋白、聚合酶、核酸内切酶、聚乙烯醇、聚焦糖，二硫苏糖醇，三磷酸腺苷，磷酸肌酶8，脱氧核糖核苷三磷酸。
4、在本专利技术的一些实施方案中，所述反应冻干粉中引物重组蛋白浓度为100～180ng/μl；所述结合蛋白浓度为80～120ng/μl；所述聚合酶浓度为20～60ng/μl；所述核酸内切酶浓度为250～450ng/μl；所述聚乙烯醇质量百分比浓度为10％～40％；所述聚焦糖质量百分比浓度为1％～3％；所述二硫苏糖醇浓度为2～6mm；所述三磷酸腺苷浓度为6～10mm，所述磷酸肌酶浓度为60～100ng/μl，所述脱氧核糖核苷三磷酸浓度为400～800μm。
5、在本专利技术的一些优选实施方案中，引物重组蛋白浓度140ng/μl、结合蛋白浓度100ng/μl、聚合酶浓度40ng/μl、核酸内切酶浓度300ng/μl、聚乙烯醇质量百分比浓度20％、聚焦糖质量百分比浓度2％，二硫苏糖醇浓度为4mm，三磷酸腺苷浓度为8mm，磷酸肌酶浓度为80ng/μl，脱氧核糖核苷三磷酸浓度为600μm。
6、在本专利技术的一些实施方案中，所述引物重组蛋白为sc-reca重组酶蛋白；所述结合蛋白为ssb蛋白；所述聚合酶为bst聚合酶；所述核酸内切酶为大肠杆菌e.coli核酸内切酶ⅳ；所述聚乙烯醇为pva1788。
7、在一些具体实施方案中，所述反应冻干粉的制备方法如下：取反应冻干粉各组分，-80℃条件下储存1～3h，随后在-20℃条件下储存5～10h，再于20℃条件下干燥1～3h即可。
8、在一些具体实施方案中，所述第一稀释液包括聚乙二醇溶液和tris溶液；所述聚乙二醇质量百分比浓度为10％～40％，所述tris浓度为20～40mm。
9、在一些具体实施方案中，所述第二稀释液包括乙酸钠溶液和乙酸镁溶液；所述乙酸钠溶液浓度为50～100mm；所述乙酸镁溶液浓度为10～50mm。
10、在一些具体实施方案中，所述扩增反应液包括hpv16和hpv18的正向引物、反向引物以及探针，其中引物和探针按照1：1混合。在一些实施方案中，所述正向引物和反向引物的浓度为10μm，体积为2μl，所述探针浓度为10μm，体积为0.6μl。
11、在本专利技术的一些具体实施方案中，hpv16和hpv18的正向引物、反向引物以及探针序列如下：
12、hpv16 l1基因上游引物：5’attacatgttacgaaaacgacgtaaacg3’
13、hpv16 l1基因下游引物：5’[botion]tcctgaataactgtgtttattaactcta3’
14、hpv16 l1基因探针：
15、5’gcagcaaatgcaggtgtggataatagagaa[fam][thf][bhq1]atatctatgg attac-c3-spacer3’
16、hpv18 l1基因上游引物：5’caatatagagtatttagggtgcagttac3’
17、hpv18 l1基因下游引物：5’[botion]catggaatccccataaggatctgcag3’
18、hpv18 l1基因探针：
19、5’tggaagatggtgatatggtagatactgga[dig][thf][bhq1]ggtgccatgga c-c3-spacer3’
20、本专利技术的第二方面提供了一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的试剂盒，包含本专利技术第一方面所述的恒温反应试剂，还包括样本裂解剂和样本检测试纸条。
21、在本专利技术的一些实施方案中，样本检测试纸条采用乳胶层析法，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于：所述恒温反应试剂包括反应冻干粉、扩增反应液、第一稀释液和第二稀释液，所述反应冻干粉组分包括引物重组蛋白、结合蛋白、聚合酶、核酸内切酶、聚乙烯醇、聚焦糖，二硫苏糖醇，三磷酸腺苷，磷酸肌酶8，脱氧核糖核苷三磷酸。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述反应冻干粉中引物重组蛋白浓度为100～180ng/μL；所述结合蛋白浓度为80～120ng/μL；所述聚合酶浓度为20～60ng/μL；所述核酸内切酶浓度为250～450ng/μL；所述聚乙烯醇质量百分比浓度为10％～40％；所述聚焦糖质量百分比浓度为1％～3％；所述二硫苏糖醇浓度为2～6mM；所述三磷酸腺苷浓度为6～10mM，所述磷酸肌酶浓度为60～100ng/μL，所述脱氧核糖核苷三磷酸浓度为400～800μM。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述引物重组蛋白为SC-recA重组酶蛋白；所述结合蛋白为SSB蛋白；所述聚合酶为B
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述反应冻干粉的制备方法如下：取反应冻干粉各组分，-80℃条件下储存1～3h，随后在-20℃条件下储存5～10h，再于20℃条件下干燥1～3h即可。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述第一稀释液包括聚乙二醇溶液和Tris溶液，所述聚乙二醇质量百分比浓度为10％～40％，所述Tris浓度为20～40mM。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述第二稀释液包括乙酸钠溶液和乙酸镁溶液，所述乙酸钠溶液浓度为50～100mM；所述乙酸镁溶液浓度为10～50mM。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述扩增反应液包括HPV16和HPV18的正向引物、反向引物以及探针，其中引物和探针按照1：1混合。
8.一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-8任一项所述的恒温反应试剂，还包括样本裂解剂和样本检测试纸条。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒恒温检测人乳头瘤病毒包括如下步骤：
10.根据权利9所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的试剂盒，其特征在于：步骤S3中，扩增反应后的样本稀释倍数为10-50倍。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于：所述恒温反应试剂包括反应冻干粉、扩增反应液、第一稀释液和第二稀释液，所述反应冻干粉组分包括引物重组蛋白、结合蛋白、聚合酶、核酸内切酶、聚乙烯醇、聚焦糖，二硫苏糖醇，三磷酸腺苷，磷酸肌酶8，脱氧核糖核苷三磷酸。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述反应冻干粉中引物重组蛋白浓度为100～180ng/μl；所述结合蛋白浓度为80～120ng/μl；所述聚合酶浓度为20～60ng/μl；所述核酸内切酶浓度为250～450ng/μl；所述聚乙烯醇质量百分比浓度为10％～40％；所述聚焦糖质量百分比浓度为1％～3％；所述二硫苏糖醇浓度为2～6mm；所述三磷酸腺苷浓度为6～10mm，所述磷酸肌酶浓度为60～100ng/μl，所述脱氧核糖核苷三磷酸浓度为400～800μm。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述引物重组蛋白为sc-reca重组酶蛋白；所述结合蛋白为ssb蛋白；所述聚合酶为bst聚合酶；所述核酸内切酶为大肠杆菌e.coli核酸内切酶ⅳ；所述聚乙烯醇为pva1788。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种用于检测人乳头瘤病毒16型、18型的恒温反应试剂，其特征在于，所述反应冻干粉的制备方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨笑笑，王景，张若寒，
申请(专利权)人：昂凯生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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