【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人乳头瘤病毒检测，尤其涉及一种检测人乳头瘤病毒16型、18型的引物探针组合及试剂盒。
技术介绍
1、宫颈癌是我国女性第二常见的恶性肿瘤，全世界每年约有47万新发宫颈癌病例，其中，我国每年新发宫颈癌病例数约占世界总发病例数的28％。研究发现，人乳头瘤病毒(hpv)是引发宫颈癌的重要因素，全世界99％的宫颈癌中均有hpv的感染，而高达80％女性在其一生中可能感染hpv。hpv16型和hpv18型是最常见的导致宫颈癌的高危亚型，位于14种hpv高危型的首位，其中宫颈鳞癌中约76.58％可检测出hpvl6，7.51％可检测出hpv18型。hpv检测方法主要有核酸pcr检测、核酸原位杂交法、液体基础细胞学检测和免疫组织化学检测等方法。其中，hpv分子检测是宫颈癌筛查的重要方法之一，可有效对感染hpv的女性进行筛查，可以显著提高肿瘤及其癌前病变的早期发现，有利于降低宫颈癌发病风险，降低患者病死率。who也曾提出hpv dna检测可作为宫颈癌早期筛查方法，并建议对hpv检测为16、18型的患者需转诊阴道镜，其他亚型感染患者不需转诊，只需定期复查。
2、大多数的hpv检测方法均基于pcr技术原理，该技术具有较高的灵敏度和特异度且高效，但是需要精密的仪器设备进行反复热变性，也需要经过培训的专业人员进行操作，成本高，操作复杂，耗时长，容易污染，不利于在医疗资源匮乏的地区使用，也不利于快速检测和现场检测。
3、目前已公开的hpv检测方法cn107557492a，基于lamp技术，20-30分钟可完成检测，对hpv
4、随着生物技术的不断发展，又鉴于我国人口规模较大的，简单快速、低成本和能够实现现场检测的恒温扩增技术应运而生。与pcr技术相比，恒温扩增技术不需要借助昂贵的精密仪器设备，具有快速、高效、恒温、高特异度、低成本等特点，而且该技术还能将样本处理和检测一体化，可以很好的实现“样本进、结果出”。因此，开发出一款可用于恒温扩增的hpv检测试剂盒，应用于宫颈癌的早期筛查，能够节省一定的医疗资源，有望早日实现消除宫颈癌的目标。
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的一种，本专利技术提供了一种检测hpv16型、18型的引物探针组合及试剂盒。该引物探针组合及试剂盒可以在恒温条件下，对人乳头瘤病毒16、18型进行分型检测。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：
3、本专利技术的第一方面提供了一种检测hpv16型、18型的引物探针组合，包括：
4、用于扩增hpv16 l1基因的引物对：正向引物序列为seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7中的一种，反向引物序列为seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8中的一种；hpv16 l1基因的序列如seq id no.1所示；
5、用于扩增hpv18 l1基因的引物对：正向引物序列为seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13中的一种，反向引物序列为seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14中的一种；hpv18 l1基因的序列如seq id no.2所示；
6、用于检测hpv16 l1基因的探针，探针序列为seq id no.15、seq id no.16、seq idno.17中的一种；
7、用于检测hpv18 l1基因的探针，探针序列为seq id no.18、seq id no.19、seq idno.20中的一种。
8、在本专利技术的一些实施方案中，用于扩增hpv16 l1基因的正向引物序列为seq idno.3或seq id no.7，反向引物序列为seq id no.4或seq id no.8，序列号相邻的两个引物序列组成引物对；用于检测hpv16 l1基因的探针序列为seq id no.16；用于扩增hpv18 l1基因的正向引物序列为seq id no.11，反向引物序列为seq id no.12，用于检测hpv18 l1基因的探针序列为seq id no.18。
9、在本专利技术的一些实施方案中，所述反向引物序列的5’端标记一个荧光基团。
10、在本专利技术的一些实施方案中，所述探针序列距离5’端30～35个碱基双“t”位置处用thf替换一个碱基，双t之间有1～3个碱基，thf位点上游位置的“t”用一个荧光基团标记，thf位点下游位置的“t”用一个猝灭基团标记，3’端用c3-spacer阻断。
11、本专利技术的第二方面提供了本专利技术第一方面所述的一种检测hpv16型、18型的引物探针组合在制备hpv检测试剂盒中的应用。
12、本专利技术的第三方面提供了一种hpv检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。
13、在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒还包括反应冻干粉、第一稀释液和第二稀释液。
14、在本专利技术的一些实施方案中，所述反应冻干粉组分包括引物重组蛋白、结合蛋白、聚合酶、核酸内切酶、聚乙烯醇、聚焦糖，二硫苏糖醇，三磷酸腺苷，磷酸肌酶8，脱氧核糖核苷三磷酸。所述反应冻干粉中引物重组蛋白浓度为100～180ng/μl；所述结合蛋白浓度为80～120ng/μl；所述聚合酶浓度为20～60ng/μl；所述核酸内切酶浓度为250～450ng/μl；所述聚乙烯醇浓度为10％～40％；所述聚焦糖浓度为1％～3％；所述二硫苏糖醇浓度为2～6mm；所述三磷酸腺苷浓度为6～10mm，所述磷酸肌酶浓度为60～100ng/μl，所述脱氧核糖核苷三磷酸浓度为400～800μm。
15、在本专利技术的一些优选实施方案中，引物重组蛋白浓度140ng/μl、结合蛋白浓度100ng/μl、聚合酶浓度40ng/μl、核酸内切酶浓度300ng/μl、聚乙烯醇浓度20％、聚焦糖浓度2％，二硫苏糖醇浓度为4mm，三磷酸腺苷浓度为8mm，磷酸肌酶浓度为80ng/μl，脱氧核糖核苷三磷酸浓度为600μm。所述引物重组蛋白为sc-reca重组酶蛋白；所述结合蛋白为ssb蛋白；所述聚合酶为bst聚合酶；所述核酸内切酶为大肠杆菌e.coli核酸内切酶ⅳ；所述聚乙烯醇为pva1788。
16、在一些具体实施方案中，所述反应冻干粉的制备方法如下：取反应冻干粉各组分，-80℃条件下储存1～3h，随后在-20℃条件下储存5～10h，再于20℃条件下干燥1～3h即可。
17、在一些具体实施方案中，所述第一稀释液包括聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测HPV16型、18型的引物探针组合，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种检测HPV16型、18型的引物探针组合，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的一种检测HPV16型、18型的引物探针组合，其特征在于：所述反向引物序列的5’端标记一个荧光基团。
4.根据权利要求1或2所述的一种检测HPV16型、18型的引物探针组合，其特征在于：所述探针序列距离5’端30～35个碱基双“T”位置处用THF替换一个碱基，双T之间有1～3个碱基，THF位点上游位置的“T”用一个荧光基团标记，THF位点下游位置的“T”用一个猝灭基团标记，3’端用C3-spacer阻断。
5.权利要求1-4任一项所述的一种检测HPV16型、18型的引物探针组合在制备HPV检测试剂盒中的应用。
6.一种HPV检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的HPV检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括反应冻干粉、第一稀释液和第二稀释液。
8.根据权利要求
9.根据权利要求8所述的HPV检测试剂盒，其特征在于：引物探针组合包括正向引物、反向引物、探针，正向引物、反向引物用量比为1:1，引物与探针用量比为(6-7)：1。
...【技术特征摘要】
1.一种检测hpv16型、18型的引物探针组合，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种检测hpv16型、18型的引物探针组合，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的一种检测hpv16型、18型的引物探针组合，其特征在于：所述反向引物序列的5’端标记一个荧光基团。
4.根据权利要求1或2所述的一种检测hpv16型、18型的引物探针组合，其特征在于：所述探针序列距离5’端30～35个碱基双“t”位置处用thf替换一个碱基，双t之间有1～3个碱基，thf位点上游位置的“t”用一个荧光基团标记，thf位点下游位置的“t”用一个猝灭基团标记，3’端用c3-spacer阻断。
5.权利要求1-4任一项所述的一种检测hpv16型、18型的引物探针组合在制备hpv...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨笑笑，王景，
申请(专利权)人：昂凯生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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