一种LAMP检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种LAMP检测试剂盒及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O本发明专利技术试剂盒操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、灵敏度高，能够防止引物产生多聚体现象，降低或阻止引物二聚体的产生，防止假阳性的产生，同时提高LAMP反应的扩增效率。

LAMP detection reagent kit and application thereof

The invention discloses a LAMP detection reagent kit and an application thereof, belonging to the field of biotechnology. The kit includes a LAMP amplification reaction system and colloidal gold strip; the LAMP amplification reaction system including LAMP primer pairs, LAMP amplification reaction solution; the LAMP primer set including inner primers FIP and BIP primers F3 and B3, the outer ring, the primers LF and LB; the LAMP amplification reaction solution containing Taq SSB protein, Bst DNA polymerase, Bst buffer, dNTPs, Mg2+, template and ddH2O kit of the invention has the advantages of simple operation, low detection cost, short detection time, high sensitivity and good specificity, can prevent the primer produced multimeric phenomenon, reduce or prevent the primer produced two dimers, prevent false positive, at the same time improve the amplification efficiency of LAMP reaction.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种LAMP检测试剂盒及应用，属于生物

技术介绍
克罗诺杆菌，2008年经过重新鉴定分型后分为：阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobactermalonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacterturicensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(Cronobactermuytjensii)、康帝蒙提克罗诺杆菌(Cronobactercondimenti)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(Cronobacteruniversalis)、都柏林克罗诺杆菌(Cronobacterdublinensis)。由克罗诺杆菌引起的致病事件虽然较少，但是一旦发生，就会导致极高的致病率，由克罗诺杆菌引起的致病能够导致能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和败血症等疾病，对于婴幼儿奶粉造成了极大的威胁。虽然并不是所有的种能够导致婴幼儿疾病，但2016年国际微生物标准建议所有的克罗诺杆菌在婴幼儿奶粉中不得检出，因此建立一种高效、快速的检测方法尤为重要。克罗诺杆菌所有种的检测尤为重要，迅速发展的分子学生物方法PCR需要仪器复杂，仪器昂贵，检测灵敏度低，而直接利用抗体特异性的检测技术的试纸条方法能通过直接观察方式进行检测，但是目前针对阪崎克罗诺杆菌的抗体特异性差，所筛选的抗体存在大量的阪崎克罗诺杆菌的漏检现象，因此存在一定的错检风险。并且目前还没有研究将LAMP技术应用到检测克罗诺杆菌这个属的水平。传统的克罗诺杆菌分离检测方法，国际上通常以美国FDA颁布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数”作为经典方法，依赖于生化和形态学特点来鉴定分离，但是传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、不易分辨结果等缺点。迅速发展的分子学生物方法PCR需要仪器复杂，仪器昂贵，检测灵敏度低。近年来快速发展的LAMP技术灵敏度高，所需仪器简单，仅需一个水浴锅即可完成检测，但目前LAMP方法检测阪崎克罗诺杆菌的结果检测大多数利用的是电泳检测方法和染料检测方法。电泳检测方法所用的凝胶染料EB是一种致癌致突变试剂，严重伤害人体健康，并且检测时间约40分钟左右；而染料法包括SYBRGreen,钙黄绿素，羟基萘酚蓝等检测，其在反应前后颜色差别存在一定的交叉性，因此会影响人体肉眼对其检测结果判断的准确性。直接利用抗体特异性的检测技术的试纸条方法能通过直接观察方式进行检测，但是目前针对阪崎克罗诺杆菌的抗体特异性差，所筛选的抗体存在大量的克罗诺杆菌的漏检现象，因此存在一定的风险。现有的LAMP技术结合试纸条的方法多数是用于病毒的检测，很少用于致病菌的检测，目前还没有研究将LAMP技术结合到试纸条方法检测阪崎克罗诺杆菌这个种的水平。同时，LAMP技术大多采用设计探针标记FITC来进行扩增产物的标记，但是这种方式增加了产品的成本和费用，并且需要额外设计探针，假阳性的概率增加。此外，LAMP检测中由于LAMP引物多，产生的引物二聚体的概率增加，并且会导致标有标记物的产物在试纸条上产生的假阳性的结果。引物二聚体是一种非特异性扩增反应下产生的非目标DNA片段，由于碱基只有4个，在引物设计以及扩增反应中不可避免的会产生非特异性扩增反应，产生引物二聚体，一方面这样消耗了反应基质中的反应底物，会降低反应的扩增效率，另一方面产生的引物二聚体会对一些最后结果判断产生误判的现象，加大了研究者的研究困难。有研究通过采用纳米金区分反应底物的方式来提高反应的扩增效率，降低引物二聚体的生成，但是采用纳米金的方式加大了实验难度和实验操作；还有研究通过采用设计核酸序列的方式来进行消除引物二聚体的方法，但是这样同样加大了实验的设计的难度，造成实验的繁琐。目前还没有一种方式来有效消除引物二聚体，从而提高LAMP的扩增效率的方式。LAMP扩增体系通常包括LAMP引物，水，dNTP,镁离子，甜菜碱，Bst酶，缓冲液等基础反应底物。LAMP特异性的引物是在针对特定性待检物进行设计的，dNTP用来提供4中碱基，Bst酶是LAMP反应体系中的核心，镁离子是用来通过影响BstDNA酶的活性来影响扩增反应，甜菜碱添加能够有效减少碱基的堆叠，从而促进LAMP的反应，以上成分缺一不可。
技术实现思路
为解决LAMP引物过多，易发生引物错配，从而反应中消耗反应底物，降低了反应的扩增效率，甚至在试纸条的标记结果中出现假阳性问题，本专利技术提供了一种LAMP检测试剂盒，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有TaqSSB蛋白，BstDNA聚合酶，Bstbuffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。本专利技术中所述TaqSSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为1ng/μL-7ng/μL。优选地，所述TaqSSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为3ng/μL-5ng/μL。最优选地，所述TaqSSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为4ng/μL。所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；所述胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；所述胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；所述反应膜4上设有检测线41和控制线42；所述检测线上埋有SA；所述控制线上埋有羊抗鼠IgG。优选地，所述SA的包被量为每厘米检测线上包被4.0μg-8.0μg；所述羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被0.6μg-1.0μg。更优选地，所述SA的包被量为每厘米检测线上包被5.0μg；所述羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被0.8μg。更优选地，所述试剂盒由LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条组成；所述LAMP扩增反应体系由LAMP引物组、LAMP扩增反应液组成；所述LAMP引物组由内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB组成；所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有TaqSSB蛋白，BstDNA聚合酶，Bstbuffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O；所述胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；所述胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；所述反应膜4上设有检测线41和控制线42；所述检测线上埋有SA；所述控制线上埋有羊抗鼠IgG。优选地，每25uL所述LAMP扩增反应体系包括：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，1ng/μL-7ng/μLTaqSSB蛋白，0.6μL-1μL8UBstDNA聚合酶，1μL-3μL10×Bstbuffer，0.8mM-2.8mMdNTPs，1mM-5mMMg2+，1μL-2μLDNA模板和ddH2O；所述外引物和内引物的浓度之比为1:3-1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2-1:5。更优选地，每25uL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。

【技术特征摘要】
1.一种LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有TaqSSB蛋白，BstDNA聚合酶，Bstbuffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqSSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为1ng/μL-7ng/μL。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；所述胶体金试纸条包括样品垫(1)，胶体金结合垫(2)，底板(3)，反应膜(4)和吸水垫(5)；所述胶体金结合垫(2)上包被有FITC抗体-胶体金标记物；所述反应膜(4)上设有检测线(41)和控制线(42)；所述检测线上埋有SA；所述控制线上埋有羊抗鼠IgG。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述SA的包被量为每厘米检测线上包被4.0μg-8.0μg；所述羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线(42)上包被0.6μg-1.0μg。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每25uL所述LAMP扩增反应体系包括：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，1ng/μL-7ng/μLTaqSSB蛋白，0.6μL-1μL8UBstDNA聚合酶，1μL-3μL10×Bstbuffer，0.8mM-2.8mMdNTPs，1mM-5mMMg2+，1μL-2μLDNA模板和ddH2O；所述外引物和内引物的浓度之比为1:3-1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2-1:5。6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测细菌和病毒中的应用。7.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测克...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，姜霞，潘瑞丽，满朝新，李明雨，赵玥明，曲艳艳，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23