本发明专利技术公开了一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒的荧光LAMP引物，所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。本发明专利技术是在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。
Fluorescent LAMP primer for detecting infectious hematopoietic necrosis virus of fish
The invention discloses a method for detecting infectious hematopoietic necrosis virus fluorescent LAMP primers, the sequence for detection of infectious hematopoietic necrosis virus fluorescence LAMP primer: SEQ ID NO:1 SEQ, ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ NO:4, SEQ ID ID NO: 5, SEQ ID NO:6. The present invention is the introduction of fluorescent dyes based on original LAMP technology, established a fluorescent LAMP detection technology, due to the use of instruments for fluorescence collection, to further improve the detection sensitivity, more objective, more convenient operation, easy standardization, easy to use.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼传染性造血器官坏死病毒检测
，尤其涉及一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物。
技术介绍
传染性造血器官坏死病毒(Infectioushematopoieticnecrosisvirus,IHNV)是影响水产养殖业的一种重要的鱼类弹状病毒。IHNV属于粒外弹状病毒属(Novirhabddovirus)，是引发传染性造血器官坏死病的病原，主要感染鲑、鳟鱼类。该病毒广泛分布于欧洲、美洲和亚洲的许多地区，属于急性、出血性、高致死性病毒病，可感染多种鱼类，引起淡、海水养殖的多种经济鱼类发生流行性病害，尤其是对鱼苗和幼鱼，能引起较高的死亡率，严重时均可达到90％以上。该病毒引起的鱼传染性造血器官坏死病(Infectioushematopoieticnecrosis,IHN)一旦暴发，将会给水产养殖业带来灾难性的损失，已被国际动物卫生组织(Officeinternationaldesepizooties，OIE)列为必须申报的疫病，《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》(联合公告第2013号)列为二类传染病、寄生虫病。目前尚缺乏控制病毒病的有效药物和方法，随未经检疫的鱼苗远途运输，使病毒宿主范围和地理分布呈扩大态势。国际上普遍采取的策略是一旦发现该病，迅速进行病鱼隔离或扑杀，从而控制该病的大规模爆发。IHN是世界各国积极进行防制的鱼类疫病。目前，常用的病毒检测方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法以及聚合酶链反应(PCR)。细胞培养分离病毒法结果可靠，但检测周期长，不适用于快速鉴别诊断，而且往往还需要其他方法进行后续检测，才能确定病毒种类。普通PCR技术的应用，提高了检测的特异性和灵敏度，缩短了检测时间，取得了一定的效果。Williams等(1999年)还报道了使用多重RT-PCR检测IPNV、IHNV和VHSV的研究，大大提高了多种病毒检测时的工作效率。但是普通PCR方法检测病毒，需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大。实时荧光RT-PCR技术的发展，使病毒检测技术得到了进一步提高，这种检测技术也被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中。实时荧光RT-PCR技术进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测，但荧光RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高。综上所述，目前鱼传染性造血器官坏死病毒检测方法存在检测周期长，步骤繁琐，工作量较大，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物，旨在解决目前鱼传染性造血器官坏死病毒监测方法存在检测周期长，步骤繁琐，工作量较大，成本较高的问题。本专利技术是这样实现的，一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物，所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6。本专利技术的另一目的在于提供一种所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中下载IHNV基因组序列，进行多序列比对，寻找IHNV的一段保守基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMPDesigner设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用DEPC水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的鱼传染性造血器官坏死病毒的检测方法，所述鱼传染性造血器官坏死病毒的检测方法包括以下步骤：步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit200说明书提取样品核酸；步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，BstDNApolymerase0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL；最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；步骤三，仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。本专利技术提供的用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物。旨在建立一种快速、准确、简单易操作的传染性造血器官坏死病毒检测方法；环介导等温扩增技术(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本Notomi等在2000年报道的一种新的核酸扩增技术。与传统的扩增技术相比，该技术扩增的特异性更强，反应过程只需在60～65℃的恒温条件下30～60min即可完成，不需要热循环。由于反应过程中不需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性，并且具有重复性好、特意性强、敏感度高和易于操作等特点。本专利技术是在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。附图说明图1是本专利技术实施例提供的用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒的检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的实时荧光LAMP检测IHNV方法建立示意图；图中：P阳性对照；N：阴性对照。图3是本专利技术实施例提供的LAMP方法特异性试验示意图；图中：1-10：鱼组织样品；N：阴性对照；P：阳性对照。图4是本专利技术实施例提供的LAMP方法灵敏度检测示意图；图中：1-9：拷贝数梯度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101；N：阴性对照。图5是本专利技术实施例提供的检测方法稳定性试验1示意图。图6是本专利技术实施例提供的检测方法稳定性试验2示意图。图7是本专利技术实施例提供的样品检测结果示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本专利技术实施例提供的用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的序列为：SEQIDNO：1FIPGCCTCTGCTACGATCCTCATCGCATGAAGTCAGTGGTGGSEQIDNO：2BIPGTACGGTGTCATGATGAGCAGGCTGGCGTTCTCGTTGATCSEQIDNO：3F3GGACTGTTCAACCAAGCCSEQIDNO：4B3ATCGTCATACCTATCGTTGATGSEQIDNO：5LFAGTCTGACAATGCGTCTGGSEQIDNO：6LBGGTACTTCAAGGCCTACGG如图1所示，本专利技术实施例提供的用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒的检测方法包括以下步骤：S101：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒的荧光LAMP引物，其特征在于，所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒的荧光LAMP引物，其特征在于，所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6。2.一种如权利要求1所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤：按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中下载IHNV基因组序列，进行多序列比对，寻找IHNV的一段保守基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMPDesigner1.1.4设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用DEPC水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。3.一种利用权利要求1所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的鱼传染性造血器官坏死病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：薄清如，罗宝正，徐海聂，赵福振，王小玉，邵建宏，廖秀云，林志达，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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