本发明专利技术公开了一种适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及快速检测方法。所述检测引物为Septin1-F3、Septin1-B3、Septin1-FIP和Septin1-BIP，其序列分别如SEQ ID NO：1～4所示。基于所述引物，本发明专利技术优化了检测步骤和系统，提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，操作简单、不需要复杂的仪器及复杂的扩增程序、检测耗时短、杂质对扩增的干扰较小，且反应结果易于判定，特异性强，为应用LAMP技术进行家蚕蚕卵微孢子虫的检测和确保蚕种健康无毒提供重要的基础和技术储备，能较好地满足科研院校、蚕种生产单位及蚕种质检中心的检毒需要，易于大范围推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及其应用和家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法。
技术介绍
家蚕微粒子病是病原性的家蚕微孢子虫(Nosemabombycis，N.b)经食下传染或胚卵(胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病，也是目前影响我国蚕丝业持续稳定发展的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的经济损失十分惨重。同时，野外昆虫微孢子虫可交叉感染家蚕，并能在蚕体间以及不同蚕期间传播，导致大批蚕种报废，严重制约蚕种贸易和蚕业可持续发展。我国将家蚕微粒子病列为进出口动物检疫二类疫病的检疫名录。各地区蚕业主管部门和相关生产单位投入大量人力、物力和财力，采取传统显微镜镜检母蛾，淘汰带毒母蛾产下的蚕种的常规方法进行防治家蚕微粒子病，但效果不佳。最初人们判别家蚕是否感染家蚕微粒子病主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行的，这种方法也有效地遏制了世界各地蚕区微粒子病的流行，拯救了世界的养蚕业。而对于家蚕蚕卵微孢子虫的检测主要是通过将产卵24h后的蚕卵浸酸处理，待蚕卵孵化收蚁后进行显微镜检测，这种方法不仅耗费了大量时间，而且显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，且很难将其他孢子类似物与家蚕微孢子虫孢子区别开来。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。目前用于家蚕微粒子病PCR检测的引物多是针对靶基因SSUrRNA的(TerryRS,SmithJE,BouchonD,etal.UltrastructuralcharacterizationandmoleculartaxonomyofNosemagranulosissp.n.,atransovariallytransmitted,feminizing(TTF)microsporidium.J.Eukaryot.Microbiol.1999,(46):492-499；HuangWei-Fone,TsaiShu-Jen,LoChu-Fang,etal.ThenovelorganizationandcompletesequenceoftheribosomalRNAgeneofNosemabombycis.FungalGeneticsandBiology,2004.41(5):473-481)。刘吉平等(刘吉平，曹阳，SmithJ.E.等.模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究.中国农业科学，2004，37(12)：1925－1931)研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带及假阳性结果出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原微孢子虫基因组DNA有效扩增。本申请人根据长期的研究实验结果，针对家蚕微孢子虫转录组测序的结果，经测序验证发现了家蚕微孢子虫Septin1基因(登录号：KF421133.1)，并在申请号为201410279224.0的中国专利中公开了septin1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用，发现以Septin1基因为靶序列设计的PCR引物检测微孢子虫并无非特异性条带及假阳性结果。但是，使用该基因设计的PCR引物对于家蚕微孢子虫检测方法操作步骤较多，且花费时间较长。况且，微孢子虫寄生于蚕卵中，且蚕卵含量明显高于要检测的微孢子虫，在提取获得的DNA样品中，两者DNA同时存在，家蚕蚕卵DNA对检测造成严重的干扰，因此，要想直接以蚕卵DNA为模板进行微孢子虫的LAMP检测，对检测提出了更高的要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术中检测蚕卵中是否感染家蚕微孢子虫所存在的操作步骤多、花费时间长、干扰大等缺陷，设计出一组适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物，基于所述引物，可成功建立家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测方法。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一组适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物，所述引物为Septin1-F3、Septin1-B3、Septin1-FIP(F1c+F2)和Septin1-BIP(B1c+B2)，其序列分别如SEQIDNO：1～4所示。SEQIDNO：1：Septin1-F3：5'-AAGGTGAAAGGATTAATGACTT-3'SEQIDNO：2Septin1-B3：5'-TCATATAATTCACTTGCTGTGTA-3'SEQIDNO：3：Septin1-FIP(F1c+F2)：5'-TCCCCATTTAAACTTCCTAACTCGATTCCATTTTTCGTTGTTTCATCT-3'SEQIDNO：4：Septin1-BIP(B1c+B2)：5'-AAGTTGATAACACGGAACACTGTCAAAACACTTAAATGTGTACCAA-3'。在本专利技术方法的关键技术之一是引物的设计，基于引物的科学设计，才能成功实现操作步骤少、花费时间短、干扰小、特异性强的LAMP检测，本申请人根据Septin1基因设计了若干组引物，经过复杂和困难的筛选工作，并对这些引物的有效性、特异性、反应时间等反复进行了分析、总结和模拟实验，综合考虑检测方法的各种影响因素，才确定所述适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物。本专利技术同时提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：S1.提取待测样品模板DNA；S2.基于所述检测引物，配置反应体系；S3.在步骤S2所配置的反应体系使用的反应管中加入20μL密封液，在管盖内侧加入1μL显色液；S4.反应：将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置60min；然后95℃，放置2min灭活；S5.结果判定：采用染色法进行结果判定：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕蚕卵微孢子虫；或者采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定：取2μL反应后的产物，与1μL6×loadingbuffer和8μLddH2O混合，于2％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不含有家蚕蚕卵微孢子虫；或者采用实时荧光法进行结果判定：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值则本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物，其特征在于，所述引物为Septin1‑F3、Septin1‑B3、Septin1‑FIP和Septin1‑BIP，其序列分别如SEQ ID NO：1～4所示。
【技术特征摘要】
1.一种适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物，其特征在于，所述引物为Septin1-
F3、Septin1-B3、Septin1-FIP和Septin1-BIP，其序列分别如SEQIDNO：1～4所示。
2.一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测样品模板DNA；
S2.基于权利要求1所述的检测引物，配置反应体系；
S3.在步骤S2所配置的反应体系使用的反应管中加入20μL密封液，在管盖内侧加入1μL
显色液；
S4.反应：将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置60min；然后95
℃，放置2min灭活；
S5.结果判定：
采用染色法进行结果判定：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；
在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕蚕卵
微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕蚕卵微孢子虫；
或者采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定：取2μL反应后的产物，与1μL6×loading
buffer和8μLddH2O混合，于2％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带，说明待
测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不含有家蚕
蚕卵微孢子虫；
或者采用实时荧光法进行结果判定：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为
阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值则为阴性。
3.根据权利要求2所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，S2所述的
反应体系是采用优化后的25μL反应体系，分别如下：
采用染色法进行结果判定的25μL反应体系为：
采用实时荧光法进行结果判定25μL反应体系为：
采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定25μL反应体系为：
4.根据权利要求3所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，所述2×
ReactionMix为反应缓冲液，组成为20mMTris-HCl，pH8.8；10mMKCl；2mMMgSO4；20mM(NH4)
2SO4；0.1％TritonX-100；2.8mMdNTPs...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，杨思佳，程伟，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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