一种TRβ基因突变检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种TRβ基因突变检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，10对1-10号外显子特异性扩增引物；该检测方法：利用TRβ基因突变检测试剂盒中的1-10号外显子特异性扩增引物对待测样品进行点突变检测，其中：利用所述扩增引物和待测样本建立PCR扩增反应体系和程序，获得PCR产物，纯化后测序。本发明专利技术给出的TRβ基因突变检测试剂盒引物通过专业设计和多次筛选，保证了引物特异性，同时引入UNG酶防污染系统，能够更加准确，稳定地对样品进行监测。本发明专利技术给出的检测方法利用特异性强，灵敏度高的扩增引物快速准确地检测TRβ基因突变，具有检测效率高，方法简单，结果准确，成本低等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测试剂盒及检测方法，特别是涉及一种TRβ基因突变检测试剂盒及检测方法，属于生物技术及医学领域。
技术介绍
甲状腺激素抵抗综合征(RTH)是由于甲状腺激素受体(TR)基因突变，导致靶器官对甲状腺激素(TH)的敏感性降低，使得TH对全身组织器官作用障碍的一种综合征。目前认为该病是一种常染色体显性或隐性遗传性疾病，有家族发病倾向，也有散发病例。根据突变受体亚型不同，分为TRα基因突变致RTH(RTHα)和TRβ基因突变致RTH(RTHβ)。1967年Refetoff首次报道RTHβ，目前全世界共报道3000多RTHβ病例，RTHβ是一类罕见的内分泌疾病，其中80％由TRβ基因突变所致，以家族性发病多见，呈常染色体显性或隐性遗传。TRβ基因突变是确诊RTHβ的金标准。RTHβ临床表现呈高度异质性，主要由于TRβ基因缺陷的严重程度及各靶器官对TH的依赖性和反应性不同。依据抵抗程度的组织分布，可分为全身型RTHβ、垂体型RTHβ。临床可表现为甲亢(甲状腺高代谢症状)或甲减(乏力、怕冷和记忆力减退等)或无明显甲功异常，或同时合并甲亢和甲减症状。临床医师易误诊为甲亢，予以抗甲状腺激素药物、放射性碘治疗或合用L-T4治疗，导致疾病症状加重，因此正确诊断很重要。目前临床诊断RTHβ主要通过L-T3抑制实验和TRH兴奋试验，但由于国内不生产L-T3和TRH，从国外购买困难，导致该疾病长期以来无法诊断。金婷等以31岁女患为研究对象，该患者以甲状腺肿就诊，伴心慌、出汗和月经减少等甲亢症状；同时有血脂异常等甲减症状。停赛治1个月后甲状腺功能显示FT3和FT4升高，而TSH不适当升高。L-T3抑制试验显示垂体组织和外周组织均存在不同程度的TH抵抗。基因测序发现患者TRβ基因出现M442T突变。诊断为全身型RTHβ(TRβ基因M442T点突变的散发病例)。2004年Bayer在国际上首次报道一个M442T突变家系，先证者表现为结节性甲状腺肿和房颤(非心脏病因)，FT3和FT4升高，TSH正常高限。目前国际上仅1例M442T报道，国内尚无该突变位点的报道。TRβ的M442T突变导致其T3依赖性转录活性受损，同时突变的TRβ干扰正常TRβ的功能，即显性负效作用，这是M442T导致RTHβ发病的分子机制。综上，建议临床遇到血清FT3和FT4升高，而TSH正常或升高患者，或确诊为甲亢后抗甲药治疗甲状腺功能一直不能恢复正常的患者，要警惕TRβ基因突变，因此临床迫切需要一种检测效率高，方法简单，结果准确，成本低的TRβ基因突变检测试剂盒及检测方法，用以提高RTHβ的确诊率。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于解决现有技术存在的上述问题，提供一种检测效率高，方法简单，结果准确，成本低的TRβ基因突变检测试剂盒及检测方法，用以提高RTHβ的确诊率。本专利技术给出的技术方案是:一种TRβ基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，10对1-10号外显子特异性扩增引物。所述PCR缓冲液包括0.5mM的MgCl2，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP，dUTP，dGTP，dCTP。所述酶溶液为高保真Taq酶和UNG酶。所述10对1-10号外显子特异性扩增引物编号为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。本专利技术还提供一种TRβ基因突变检测方法，包括以下步骤。(1)制备本专利技术的TRβ基因突变检测试剂盒。(2)提取待测样品，进行PCR反应。(3)PCR产物纯化测序，获得TRβ基因突变检测结果。其特征在于，利用TRβ基因1-10号外显子特异性扩增引物对待测样品进行点突变检测，包括。利用所述扩增引物和待测样本建立PCR扩增反应体系和程序，获得PCR产物，纯化后测序。所述PCR扩增反应体系如下。所述PCR扩增反应程序如下。所述PCR产物纯化处理所用试剂可以为市面上任何一款PCR产物纯化试剂。所述PCR产物纯化处理后测序，经过对测序图谱的分析来确定TRβ基因的突变与否。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是。本专利技术TRβ基因突变检测试剂盒引物通过专业设计和多次筛选，保证了引物特异性，同时引入UNG酶防污染系统，能够更加准确，稳定地对样品进行监测。本专利技术的检测试剂盒及检测方法具有检测效率高，方法简单，结果准确，成本低等特点，因此本专利技术具有实质性的技术效果，便与推广。附图说明图1：患者TRβ基因第10外显子部分测序图。患者TRβ基因第10外显子的第442位密码子处存在点突变，密码子由ATG改变为ACG，编码的蛋白质由蛋氨酸变为苏氨酸(M442T)。进一步分析其基因测序图，该突变为杂合子突变。患者父母的TRβ基因未发现该突变。图2.对实施例2的患者TRβ全长外显子1-10进行PCR扩增及测序，A:患者，B:患者父亲，C:患者母亲，D:患者姐姐，测序结果显示，患者第10号外显子的第453位密码子存在点突变，密码子从CCT突变为ACT，导致其所编码的蛋白质由脯氨酸变为苏氨酸。而患者父母和姐姐均未发现该突变。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TRβ基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，10对1‑10号外显子特异性扩增引物。

【技术特征摘要】
1.一种TRβ基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，10对
1-10号外显子特异性扩增引物。
2.根据权利要求1所述的TRβ基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括
0.5mM的MgCl2，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP，dUTP，dGTP，dCTP。
3.根据权利要求1所述的TRβ基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述酶溶液为高保真
Taq酶和UNG酶。
4.根据权利1要求所述的TRβ基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述10对1-10号外显
子特异性扩增引物编号为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、SEQ
IDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQ
IDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕晓春，滕卫平，单忠艳，金婷，王冉冉，梁越，何雪，张涵祎，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21