遗传性耳聋基因突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术用于定性检测基因组DNA中与耳聋相关的基因20个位点的突变检测试剂盒。该试剂盒包括DNA稀释液、杂交反应液、耳聋探针混合液A，耳聋探针混合液B、连接反应液A、连接酶，连接反应液B、聚合酶、PCR扩增引物混合液，阳性对照，阴性对照。本发明专利技术提供的试剂盒，主要采用多重连接探针扩增技术（MLPA）与毛细管电泳结合的方法进行基因突变检测，不仅可以同时对多个突变位点进行检测，两管同时准确判断20个位点的野生型、纯合突变型和杂合突变型，还同时设计引物探针，有很高的准确度与特异度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，主要体现的是MLPA方法与测序结合技术的应用，尤其涉及一种非综合性遗传性耳聋基因多态性位点检测。
技术介绍
据发达国家统计，每1000个新生儿中，就有1名听力障碍患者。在我国，听力言语残疾者达2780万以上，占残疾人总数的24.16%，每年新生3万聋儿。研究推测60%的耳聋发病与遗传有关，且有120多个耳聋基因已经被鉴定。也因此，越来越多的国家都在开展新生儿耳聋基因筛查工作。随着2011年国务院印发的《中国妇女发展纲要(2011-2020年)》和《中国儿童发展纲要(2011-2020年)》的颁布，耳聋筛查更是进一步成为各级卫生部门和医疗机构的重要工作，从而力争实现2020年前新生儿听力筛查率达到60%以上。在这一计划的实施过程中，各种耳聋基因检测方案不断出现，并通过医院合作，政府买单的形式在不同地区先后落地。据统计，目前每年的耳聋基因检测量约100余万，在未来5年实现年检测量1000万新生儿（60%筛查率）意味着每年60%的复合增长率。技术的演进、临床操作的对比，让更多的医院希望寻求到升级的检测产品，以实现最大的检测销量、最低的检测成本、最高的检出率，以及最全面的后续分析和最先进的高通量测序技术支持。根据相关文献及国家耳聋项目研究团队学术会议汇报，大约21%的耳聋患者带有GJB2基因突变，14.5%的耳聋患者带有SLC26A4基因突变，另外分别有3.8%和0.6%的耳聋患者带有线粒体DNAA1555G和C1494T突变。这一结果揭示了中国耳聋患者常见耳聋突变的发生频率，确定了GJB2、SLC26A4、线粒体基因12SrRNA（A1555G和C1494T突变）是导致中国大部分遗传性耳聋发生的三个最为常见的基因，约70-80%的遗传性耳聋个体由这三个基因的突变导致。在大量的临床检测数据支持下，我们统计出中国人群中最高频的耳聋基因突变位点。在此基础上，列为检测靶点的20个耳聋基因突变位点不仅可以覆盖绝大多数的耳聋基因突变位点，同时也是目前学术界认可的与遗传性耳聋相关的致病突变位点，此外还加入了GJB3基因上的2个突变位点。GJB3基因与后天高频感音神经性耳聋有关，是我国本土克隆的第一个遗传疾病基因，突变比率在耳聋人群中约为1.2%。近年来，国内相继报道了先天性耳聋基因或者易感性耳聋基因的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对耳聋相关基因突变进行广泛的筛查的需要，目前检测耳聋基因DNA的方法主要基于芯片技术、测序技术和荧光检测技术，存在操作复杂，耗时长，成本高及对操作人员要求高等不足问题。无锡中德美联生物技术有限公司于2013年申请了一种遗传性耳聋基因荧光检测试剂盒，该专利技术是一种可以同时检测四个耳聋相关基因17个热点突变的检测试剂盒。其采用的主要方法是荧光标记和ARMS-PCR，采用多重PCR体系进行检测，该方法具有快速、简便的特征，但是该试剂针对临近突变位点判断不准确，同时由于采用四色荧光标记，在仪器需求上增加了难度，这些特点限制了其应用的广泛性。目前临床上对耳聋基因的检测主要集中在基因DNA分子水平，具有很高的特异识别能力。本专利技术结合MLPA方法和测序技术的诸多检测优势，在GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体基因上同时挑选一些在中国地区热点突变的多态性位点位点，构成优化操作系统，具有检测位点数量多、高检出、低成本、易操作等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是：利用MLPA方法提供一种高通量、准确度高、特异性强遗传性耳聋基因检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：MLPA技术具有极强的应用潜力和广阔的发展前景。连接酶检测反应是一种高特异性基因检测技术，其主要基于核酸特异杂交原理，只有在SNP位点上下游两条寡核苷酸探针与待测DNA序列完全互补，且两条探针之间没有碱基空隙时，才能在TaqDNA连接酶的作用下发生连接反应，之后通过荧光检测设备扫描探针上所带的荧光信号确定片段长度，实现对SNP位点的检测。基于MLPA技术原理，通过设计不同长度的探针结合荧光检测分析可以实现1~20个位点的SNP分型要求。每个MLPA探针包括两个寡核苷酸片段，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。一种遗传性耳聋基因检测试剂盒及应用，其特征在于：包括有如下20个多态性位点的探针:35delG，G1975C，GIVS15+5A，T2027A，299-300delAT，167delT，176-191del16，235delC，C538T，AIVS7-2G，C1229T，G1226A，A1174T，A2168G，C1494T，A1555G，C2162T，G598A，C281T，G547A。更进一步地，试剂盒可以包括有如下表1中20个多态性位点的探针：表1各位点探针序列以上探针，每个位点都包括有四条等位基因特异性非标记探针，分别用于杂交产生野生型和突变型目的基因碱基序列，另外还有一条通用引物，用于扩增目标基因碱基序列，获得大量目标基因序列。表1中，“W”编号指等位基因杂交探针野生型，“M”编号指等位基因杂交探针突变型，“F”编号指左侧杂交探针，“R”编号指右侧杂交探针。所述的20个多态性位点的探针分为二组。第一组：299_300delAT，C538T，C2162T，AIVS7-2G，G589A，GIVS15+5A，167delT，G1226A，G1975C，235delC，A1555G第二组：T2027A，C1229T，176_191de116，G547A，A1174T，C281T，35delG，A2168G，C1494T。这样做的优点在于避免非特异性扩增的可能性。本专利技术所涉及的DNA稀释液包括10mMpH8.2Tris-HCl，0.1mMEDTA。杂交反应液包括1.5MKCl，300mMpH8.5Tris–HCl，1mMEDTA。连接反应液A包括0.2mM辅酶NAD。连接反应液B包括2.6mMMgCl2，5mMpH8.5Tris–HCl，0.013%非离子去污剂。耳聋探针混合液A包含11个位点的探针混合液。耳聋探针混合液B包含9个位点的探针混合液。PCR扩增引物混合液2.5nmoldNTPs，10pmolPCR通用扩增引物。阳性对照耳聋20个突变型位点的质粒混合物。阴性对照耳聋20个野生型位点的质粒混合物。连接酶是指购于NEB的TaqDNA连接酶，这是一种热稳定性酶且具有高特异性，因为只有在上下游两条寡核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括有如下信息：DNA稀释液、杂交反应液、20个耳聋基因位点、耳聋探针混合液A、耳聋探针混合液B、连接反应液A、连接酶、连接反应液B、聚合酶、PCR扩增引物混合液、阳性对照、阴性对照。

【技术特征摘要】
1.二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括有如下信息：DNA稀释液、杂交反应液、20个耳聋基因位点、耳聋探针混合液A、耳聋探针混合液B、连接反应液A、连接酶、连接反应液B、聚合酶、PCR扩增引物混合液、阳性对照、阴性对照。2.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA稀释液成分为Tris–HCl、EDTA。3.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的杂交反应液成分为：KCl、Tris–HCl、EDTA。4.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的20个耳聋基因位点分为两组，第一组：299_300delAT，C538T，C2162T，AIVS7-2G，G589A，GIVS15+5A，167delT，G1226A，G1975C，235delC，A1555G；第二组：T2027A，C1229T，176_191de116，G547A，A1174T，C281T，35delG，A2168G，C1494T。5.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接酶指的是：购于NEBTaqDNA连接酶（NEB）。6.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接反应液A指的是：辅酶NAD。7.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接反应液B指的是：MgCl2，Tris–HCl，非离子去污剂。8.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增混合物指的是：FAM上游通用引物,序列为：5'-FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3'；下游通用引物，序列为：5'-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3'，dNTPs。9.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的聚合酶指的是：购于NEBTherminator™DNA聚合酶。10.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耳聋探针混合液A指的是:11个位点的探针混合液。11.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耳聋探针混合液B指的是:9个位点的探针混合液。12.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照指的是：耳聋20个突变型位点的质粒混合物。13.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照指的是：耳聋20个野生型位点的质粒混合物。14.根据权利要求2所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马爽，贺綦，高蕾，郭广雨，
申请(专利权)人：哈尔滨星云生物信息技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23