一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用技术

本发明专利技术属于临床医学基因检测技术，具体涉及一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用，所述试剂盒包含针对TERT基因的荧光标记探针。本发明专利技术设计仅需一对探针和一对引物，所发现为特异性C228T型突变，约占膀胱癌TERT突变的99％；且检测方法试剂简单，价格低廉，而且反应体系中仅含有最基本的引物和探针，影响因素少；本发明专利技术方法检测精准，操作简单，为临床医学上快速检测膀胱癌奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床医学基因检测技术，具体涉及一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用。
技术介绍
膀胱尿路上皮癌是泌尿道的最常见的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的2.52％。按性别统计，膀胱癌男、女性发病率分别为10.10/10万和3.20/10万，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47％。此癌多数组织学表现为分化良好的乳头状病变。尿细胞学在诊断高级别肿瘤中有较高的灵敏度和特异性，但是在检测高分化低级别肿瘤时表现较差，其灵敏度和特异性较低，尤其以伴有非肿瘤性病变，如感染时为甚。目前常用的方法是尿液细胞学检查。虽说尿细胞学在高级别肿瘤检测中具有合理的灵敏度和特异性，但是其检测低级别肿瘤常有困难，其灵敏度和特异性均较低。目前应用的尿基肿瘤标记物，包括食品和药物管理局(FDA)批准的Immunocy，核基质蛋白22，和荧光原位杂交(FISH)具有较高的灵敏度和特异性。但是各项检查性能不一致，价格高昂，受标本因素影响较大，妨碍了其广泛的临床使用。端粒反转录酶(TERT)激活性突变导致端粒酶的表达增加，是尿路上皮癌的最常见的突变，出现于80％的膀胱癌中，而且与癌的分化水平无关。现在已经被认定为膀胱癌的驱动突变，其突变的检测为膀胱癌的诊断提供了较好的目标基因。TERT启动子突变发生于致癌过程早期，结合膀胱癌的外生性倾向，使细胞极易于脱落于尿液中，为TERT突变经尿液脱落细胞诊断膀胱癌成为可能。TERT突变的检测不但可用于临床诊断和筛查，而且极为适合复发监测。现有的无创筛查和监测膀胱癌尿基标记物，包括食品和药物管理局(FDA)批准的试验Immunocy，核基质蛋白22(NMP22)，UroVysion原位荧光杂交具有70％的总灵敏度和高达89％的特异性。但是各项检查性能不一致，价格相对昂贵，妨碍了其广泛的临床使用。端粒酶逆转录酶的启动子(TERT)基因激活性突变在导致端粒酶的表达增加，是膀胱癌的致癌驱动因子。TERT启动子突变被发现于80％的膀胱性尿路上皮癌，并且与肿瘤分级分期无关，是一个理想的诊断和监测指标。CN104805206A公开了检测TERT基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对TERT基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％TERT基因突变DNA的样本、最低检出限为2-5拷贝。但是该试剂盒反应体系复杂，影响因素多，每一因子均可对反应结果和解读产生影响，难以解读；貌似可以探知几乎所有突变，然C228T以外的突变在总突变中所占权重约为1％，并且混合的多重PCR不能明确病人为何种突变，尚需要测序来确定具体突变，如果用单纯PCR，则需要做多次PCR反应，工作量大。
技术实现思路
本专利技术应用实时PCR融解技术,检测TERT基因启动子突变.本专利技术设计仅需一对探针和一对引物，所发现为特异性C228T型突变，约占膀胱癌TERT突变的98％；且检测方法试剂简单，价格低廉，而且反应体系中仅含有最基本的引物和探针，影响因素少；本专利技术方法检测精准，操作简单，为临床医学上快速检测膀胱癌奠定了基础。第一方面，本专利技术提供了一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒，所述试剂盒包含针对TERT基因的荧光标记探针。本专利技术，当检测TERT基因启动子存在突变时，突变特异性探针与基因组DNA特异性结合，而野生型DNA则因为有单点的不配对，而形成“泡”，从而显示较低的熔点。优选地，所述荧光标记探针包括供体探针和受体探针。优选地，所述供体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段，所述受体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2所示的片段；所述探针的核苷酸序列如下：供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’(SEQIDNO.1)；受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’(SEQIDNO.2)。优选地，所述试剂盒还包括检测TERT的特异性引物。优选地，所述特异性引物的核苷酸序列包含如SEQIDNO.3-4所示的片段；所述特异性引物的核苷酸序列如下：上游引物：5’-cccttcaccttccagctc-3’(SEQIDNO.3)；下游引物：5’-agcgctgcctgaaactgg-3’(SEQIDNO.4)。优选地，所述试剂盒所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、OneTaqDNA聚合酶。本专利技术中，所有试剂包括特异性引物，荧光探针，及PCR缓冲液，dNTPs(除酶之外)均已混合，作为“主液”，不需要单独配制，极大地方便用户操作。所述PCR缓冲液的浓度为1×缓冲液。优选地，所述dNTPs的浓度为dNTPs的浓度为0.05-1μM，例如可以是0.05μM、0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM，优选为0.1-0.8μM，进一步优选为0.2μM。优选地，所述OneTaqDNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg，例如可以是0.5U/mg、0.6U/mg、0.7U/mg、0.8U/mg、1U/mg、1.2U/mg、1.5U/mg、2U/mg、2.5U/mg、3U/mg、3.5U/mg、4U/mg、4.5U/mg、5U/mg、5.5U/mg、6U/mg、6.5U/mg、7U/mg、7.5U/mg或8U/mg，优选为1-5U/mg，进一步优选为1.5U/mg。第二方面，本专利技术提供一种利用如第一方面所述的检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，包括以下步骤：(1)从待测样品中提取模板DNA5-20ng，利用SEQIDNO.3-4的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；(2)将步骤(1)扩增后的片段加入SEQIDNO.1-2的荧光探针进行加温熔解；(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。优选地，步骤(1)所述的模板来自于尿液细胞沉淀物和/或膀胱组织。优选地，步骤(1)所述的扩增条件为：(a)95℃预变性4min，1循环；(b)94℃变性20s、62℃退火20s、68℃延伸40s，45个循环；(c)37℃延伸30s，1循环。优选地，步骤(2)所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对TERT基因的荧光标记探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对TERT基
因的荧光标记探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记探针包括供体探针和受体
探针；
优选地，所述供体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段，所述受体探针的
核苷酸序列包含如SEQIDNO.2所示的片段。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测TERT的特异
性引物；
优选地，所述特异性引物的核苷酸序列包含如SEQIDNO.3-4所示的片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲
液、dNTPs、OneTaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为0.05-1μM，优选为
0.1-0.8μM，进一步优选为0.2μM；
优选地，所述OneTaqDNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg，优选为1-5U/mg，进一步优选为
1.5U/mg。
6.一种利用如权利要求1-5中任一项所述的检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾
病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取模板DNA5-20ng，利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓友平，王红卫，张绍波，
申请(专利权)人：苏州捷诺威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32