多重聚合酶链式反应方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种多重聚合酶链式反应方法。该方法包括步骤：(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；(B)进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和(C)对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测。本发明专利技术方法可在含低拷贝量复杂模板的、极易产生非特异性扩增的多重PCR反应体系中，非常高效而准确地扩增出全部特异性扩增产物。本发明专利技术方法可广泛用于各种不同的检测领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多重聚合酶链式反应方法，具体地涉及该多重聚合酶链式反应方法在低拷贝数量、高度复杂模板中高效及精准扩增目的核酸序列的应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)能够以少量DNA为模板，并将目标DNA片段在短时间(几小时)内以指数扩增的方式大量富集。多重PCR可以在一个反应中对多个基因同时进行扩增，与常规PCR技术相比具有高效、省时、省样本等优势，因此该技术已成为临床和基础研究中一种快捷简便的基因检测方法。然而，由于在多重PCR反应体系中，高浓度的多种引物间会发生相互作用，严重影响了扩增的特异性和均一性，并导致扩增灵敏度和产量的降低。这些问题大大限制了多重PCR的应用。目前，解决这个问题的传统方法有：使用特殊的软件来设计多重PCR的引物(如MPprimer等)、优化反应组分和热循环条件(Markoulatos,P.,Siafakas,N.,Moncany,M.Multiplexpolymerasechainreaction:Apracticalapproach.[J].JournalofClinicalLaboratoryAnalysis.,2002,16:47-51；Henegariu,O.,Heerema,N.A.,Dlouhy,S.R.,etal.MultiplexPCR:Criticalparametersandstep-by-stepprotocol[J].Biotechniques,1997,r>23:504-511)。传统方法主要依赖大量的条件摸索和经验的积累。除了基于经验的传统方法外，已有几种巧妙的策略来提高多重PCR的特异性。例如：利用复合引物(compositiedprimers)与巢式PCR相结合的策略也能较好的改善多重PCR的特异性和产量的问题(US2009/0253183A1、US2010/0291668A1)。这一策略在引物设计时，将一段序列完全相同的引物加入到每一个特异性引物的5'端(通用序列)，从而组成复合引物。这一序列完全相同的引物称为通用引物(commonprimer)，它的序列与待扩增的模板不具有同源性。每一个复合引物由两部分组成：靠近5'端的通用引物和靠近3'的特异引物。在第一轮扩增中，复合引物中只有特异性序列的能与模板配对并扩增，因此第一轮扩增能将各DNA目标片段扩增出来；此外，由于每个特异引物的末端都附加有一段通用引物的序列，因此在每一个扩增的产物的两端都具有相同的序列。在第二轮扩增中，只需加入一种序列(通用引物)即可完成所有目标产物的扩增。此外，在引物合成是加入非天然的人工碱基也能明显改善多重PCR的特异性。也有人报道称在多重PCR中引入一种单链结合蛋白RecA也能改善多重PCR的特异性。然而，上述对多重PCR的改进方法都有一定缺点。传统的优化方法依赖大量的实验来优化反应条件，且在不同的扩增体系下最佳的优化条件需要重新优化，需要耗费大量的时间和试剂。利用通用引物和巢式PCR的策略的实验较简单且效果较好，但这一策略需要保证通用引物的序列与DNA模板无同源性，这增加了实验设计的难度；巢式PCR需要将第一轮产物进行第二轮扩增，这增大了实验室交叉污染的风险。此外，在第一轮扩增中引物仍然可能因相互作用而产生非特异扩增，特异性的降低和扩增非均一性的问题仍然难以避免。综上所述，上述多重PCR的优化策略会有优化过程复杂、需要特殊仪器、费用昂贵等问题。本质上，多重PCR的问题主要是因大量不同序列的引物之间的相互干扰和竞争引起。这些相互作用会导致引物二聚体、引物与模板错配等，进而导致非特异产物。由于在PCR过程中，这些非特异扩增与特异性扩增竞争PCR反应底物，减少了特异性产物的产量，导致灵敏度低的问题。这些问题极大的降低了基于多重PCR的检测方法的特异性和灵敏度。因此，从引物的相互作用角度出发对PCR体系进行改进，使得PCR具有一种能选择性抑制非特异扩增、增强特异性扩增的能力就可以有效提高多重PCR的特异性和灵敏度；此外，从实际应用的角度出发，建立一种操作简单、廉价且具有广泛适用性的多重PCR改进方法是十分重要的。近年来，随着纳米技术的发展，许多纳米材料已被用于PCR的优化，如纳米金、纳米银、量子点、纳米多聚物和纳米碳材料等。这些材料可不能程度的改善PCR中出现的各种问题，但各类材料优化效果各有不同，且只是对常规PCR(单重PCR)的优化。氧化的石墨烯材料是种新型的二维碳材料，具有比表面积大、导热性良好等性质。目前，人们已发现氧化石墨烯能吸附DNA(单链DNA和双链)；此外，氧化石墨烯能有效降低含有错配的单链DNA的配对效率。因此氧化石墨烯的特异性能很好的选择性抑制非特异配对和扩增，从而提高多重PCR的特异性和灵敏度。这种方法不需要对各个引物对进行特殊的设计，也无需进行容易导致污染的二次扩增，可以大大简化实验流程和降低交叉污染的风险。此外，大规模生产分散均匀的氧化石墨烯水溶液的制备方法成熟，成本低廉。因此，利用氧化石墨烯作为添加剂优化多重PCR可建立一种操作简单、低成本且具有广泛适用性的多重PCR优化策略。目前，未见报道将氧化石墨烯用于多重PCR技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种氧化石墨烯在多聚合酶链式反应中作为优化剂和增强特性剂的应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种多重聚合酶链式反应方法，包括步骤：(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；(B)对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和(C)任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测，其中，所述的用于扩增的引物对包括3-30个引物对。在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨烯的含量为100－500ng/25微升；较佳地150－400ng/25微升；较佳地200－300ng/25微升。在另一优选例中，各引物对中上游引物与下游引物之比为约0.8-1.2：0.8-1.2，较佳地为约1：1。在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨烯的含量与所述代扩增模板的含量之比为：100-500ng：5-25ng；较佳地150-400ng：5-25ng；更佳地200-300ng：5-25ng。在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，所述模板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括步骤：(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；(B)对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和(C)任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测，其中，所述的用于扩增的引物对包括3‑30个引物对。

【技术特征摘要】
1.一种多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括步骤：
(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于
扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；
(B)对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含
扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产
物；和
(C)任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测，
其中，所述的用于扩增的引物对包括3-30个引物对。
2.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，在适量氧
化石墨烯存在下，所述的多重聚合酶链式反应中以同样的退火温度或氧化石墨烯
浓度在低拷贝模板的条件下能扩增出全部特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琛，张东华，张益，胡钧，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31