反转录反应液及制备cDNA的方法技术

本发明专利技术提出了一种反转录反应液及其一种制备cDNA的方法。本发明专利技术所提出的反转录反应液和利用该反转录反应液制备cDNA的方法，具有操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的，本专利技术涉及一种反转录反应液及一种制备cDNA的方法。
技术介绍
基因表达与调控的分析与检测是现代分子生物学和医学研究领域中的重要课题。近年来随着基因表达调控分析检测技术的发展，相关的检测技术也越来越多，比如：原位杂交、Northern杂交、RNA酶保护实验、基因芯片分析、实时定量PCR分析以及反转录PCR分析(RT-PCR)等。其中的RT-PCR分析由于操作简单，检测mRNA水平灵敏，被认为是检测基因表达的主要手段之一。RT-PCR是一种将反转录(ReverseTranscription；RT)反应和PCR(PolymeraseChainReaction)反应组合在一起的检测技术。其中的RT(反转录)反应是RT-PCR技术的关键，它是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成与模板mRNA互补的DNA即cDNA的过程。cDNA的合成和克隆技术已经成为当今分子生物学研究的重要手段。合成cDNA第一链的方法离不开依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用。目前非常常用且已经商品化的反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶和鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶这两种。通常情况下，RT反应过程由3个步骤组成：首先通过高温将RNA模板的二级结构打开；其次通过反转录酶催化反转录反应；最后通过高温对反转录酶进行灭活，以保证后续PCR过程的顺利进行。然而，如何进一步提高cDNA的合成效率仍有待进一步开发。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：反转录常规的操作流程需要3个不同的反应温度，且反应体系配制过程复杂，容易出错，另外，整个操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，耗时费力。所以，常规的反转录反应，不但会给实验操作者带来不便，而且越来越不能满足基因分析的高速、高通量的需求。目前一些商品化试剂盒中不乏反应快速和操作简便的产品，但是反应效果一般，重复性不好，很难得到推广。基于上述问题，在本专利技术中，专利技术人提出了一种操作简便，反应快速的反转录反应液，以此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理所需时间仅为15分钟，反转录反应效果佳，重复性好。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种反转录反应液。根据本专利技术的实施例，所述反转录反应液包括：0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；30～50毫摩尔/升硫酸铵；6～10毫摩尔/升氯化镁；0.2～0.4摩尔/升氯化钠；2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；100～300毫摩尔/升海藻糖；0.001％～0.005％(质量体积比)明胶；1～3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸；脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；10～30微摩尔/升的随机引物；25～75个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；1.5～2.1个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5％～1％(体积比)甘油；以及余量的水。根据本专利技术的实施例，利用本专利技术所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。根据本专利技术的实施例，上述反转录反应液还可以具有下列附加技术特征之一：根据本专利技术的实施例，所述反转录反应液的pH为8.0～8.8。pH为8.0～8.8时，MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时活性高、效率高。根据本专利技术的实施例，优选反转录反应液的pH为8.3，最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本专利技术实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度进一步提高、反应效果和可重复性进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述氯化钠的用量是0.3摩尔/升，所述硫酸铵的用量是40毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述乙二醇双四乙酸的用量是1.6毫摩尔/升，所述明胶的用量是0.002％(质量体积比)，所述甘油的用量是1％(体积比)。在上述氯化钠、硫酸铵、二硫苏糖醇、乙二醇双四乙酸、明胶和甘油的用量下，利用本专利技术实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度、反应效果和可重复性的到更进一步显著提高。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了前面所述的反转录反应液在RNA样本的反转录处理中的用途。根据本专利技术的实施例，利用本专利技术所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种制备cDNA的方法。根据本专利技术的实施例，包括：利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。根据本专利技术的实施例，本专利技术提出的制备cDNA的方法具有和本专利技术提出的反转录反应液相同的效果和优点，即本专利技术提出的反转录反应快速、效果好、可重复性高。根据本专利技术的实施例，上述制备cDNA的方法还可以具有下列附加技术特征之一：根据本专利技术的实施例，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。常规反转录处理所需时间是60～65分钟，本专利技术所提出的制备cDNA的方法是15分钟，反应快速。根据本专利技术的实施例，所述反转录处理进一步包括：(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于50纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为5微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理，以便获得所述cDNA。根据本专利技术的实施例，本专利技术所提出的制备cDNA的方法具有反应快速、反应效果好、可重复性高的特点。根据本专利技术的实施例，所述水是去离子水。去离子水可防止RNase对RNA的降解、防止水中离子对反应体系的干扰以及避免非特异性产物的生成。因此，反转录处理过程中使用去离子水进一步提高了本专利技术提出的制备cDNA方法的稳定性和可重复性。根据本专利技术的实施例，所述混合是在4摄氏度下进行的。在4摄氏度下进行混合处理，保证了RNA样品的稳定和反应体系中反转录酶的稳定。因此，混合处理在4摄氏度下进行保证了本专利技术所提出的制备cDNA的方法的稳定性和可靠性进一步提高。附图说明图1是根据本专利技术实施例1的通过本专利技术提出的制备cDNA的方法制备的cDNA进行荧光定量PCR的检测图；图2是根据本专利技术实施例1的通过常规反转录方法制备的cDNA进行荧光定量PCR的检测图；以及图3是根据本专利技术实施例2的通过本专利技术提出的制备cDNA的方法和常规反转录方法<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液包括：0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；30～50毫摩尔/升硫酸铵；6毫摩尔/升～10毫摩尔/升氯化镁；0.2～0.4摩尔/升氯化钠；2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；100～300毫摩尔/升海藻糖；质量体积百分数为0.001％～0.005％的明胶；1～3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸；脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；5～20微摩尔/升的Oligo‑dT15引物；10～30微摩尔/升的随机引物；25～75个单位/微升的鼠白血病病毒反转录酶；1.5～2.1个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5体积％～1体积％甘油；以及余量的水。

【技术特征摘要】
1.一种反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液包括：
0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；
30～50毫摩尔/升硫酸铵；
6毫摩尔/升～10毫摩尔/升氯化镁；
0.2～0.4摩尔/升氯化钠；
2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；
100～300毫摩尔/升海藻糖；
质量体积百分数为0.001％～0.005％的明胶；
1～3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸；
脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；
5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；
10～30微摩尔/升的随机引物；
25～75个单位/微升的鼠白血病病毒反转录酶；
1.5～2.1个单位/微升的RNA酶抑制剂；
0.5体积％～1体积％甘油；以及
余量的水。
2.根据权利要求1所述的反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液的pH为8.0～
8.8，优选的pH为8.3。
3.根据权利要求1所述的反转录反应液，其特征在于，所述氯化钠的用量是0.3毫摩
尔/升，所述硫酸铵的用量是40毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述乙
二醇双四乙酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张双宇，刘玉方，李晓晨，孙克非，
申请(专利权)人：天根生化科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11