猪外周血单核淋巴细胞PD-L2重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子病理学与免疫学技术领域，涉及猪外周血单核淋巴细胞PD-L2重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。通过采集猪外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；采用普通PCR扩增PD-L2目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；将PD-L2目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，按拷贝浓度绘制成标准曲线；根据荧光信号变化及标准曲线测出PD-L2的基因丰度。本发明专利技术的猪PD-L2基因丰度实时检测方法具有检测通量高、敏感性高、特异性强、操作简便、成本低及定量准确等优点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
猪外周血单核淋巴细胞PD‑L2实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：采集仔猪的外周血，分离出外周血单核淋巴细胞，提取外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于‑20℃，采用普通PCR方法扩增PD‑L2目的基因片段；采用普通PCR方法扩增PD‑L2目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将PD‑L2目的基因纯化片段与pMD 18‑T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；其中普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20µmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA 聚合酶，其余为无菌三蒸水；普通PCR反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min；其中，正向引物F为：5′‑ GCCAACACCAGCTATACCAAGAC ‑3′,反向引物R为：5′‑ GGGATGAAAACACGGAGCA ‑3′。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王选年，朱艳平，岳锋，张艳芳，孙国鹏，李鹏，张万方，杨媛，王爱国，李博文，王军，李鹏，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：河南;41