PEG修饰的CpG寡核甘酸及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种疫苗和肿瘤免疫治疗给药系统领域的PEG修饰的CpG寡核甘酸及其应用。本发明专利技术涉及一种PEG修饰的CpG寡核甘酸；本发明专利技术还涉及所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸在制备提高血清中的IL-12表达量药物中的应用；本发明专利技术还涉及所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸在制备诱导对于内源性抗原如肿瘤抗原的免疫源性药物中的应用。本发明专利技术还涉及所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸在制备刺激B细胞、浆细胞样树突状细胞、髓系树突状细胞、巨噬细胞、外周单核细胞的免疫活性药物中的应用。本发明专利技术涉及PEG修饰的CpG；具有增加体内稳定性及免疫调节功能，能提高在体内对于持续存在的抗原的应答反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于疫苗和肿瘤免疫治疗给药系统领域，具体涉及一种PEG修饰的CpG寡核甘酸及其应用。
技术介绍
CpG寡聚脱氧核糖核苷酸（oligodeoxynucleotides,ODN）是一些人工合成的以具有免疫激活功能的CpG序列（胞嘧啶-磷酸-鸟嘧啶）基序为核心的寡聚脱氧核苷酸，其结构特征为5’-PuPuCPGPyPy-3，既5’端有两个嘌呤或者一个嘌呤接一个胸腺嘧啶，3’端有两个嘧啶的寡核苷酸序列。在19世纪90年代，美国肿瘤医生Coley将细菌粗提取物用于900名长期肿瘤患者的治疗中时，发现有40%的病人肿瘤自行消退。在当时，人们认为是其中的脂多糖发挥作用，而没有引起足够的重视。在后来，用卡介苗进行小鼠体内试验时发现，DNA酶处理过的卡介苗并不具有抗肿瘤作用，这说明细菌DNA才是发生抗肿瘤作用的药物。之后，有研究证实，细菌DNA有直接的抗肿瘤和免疫刺激的作用。1995年，Krieg等发现细菌DNA中，发生较强免疫作用的是CpG基序，并把这类序列成为免疫刺激序列。与细菌不同，哺乳动物和其他动物的DNA分子中CpG基序的出现频率很低，同时60%-90%的CpG基序中，胞嘧啶的第五个碳原子发生甲基化，因为这一变动，哺乳动物的DNA分子并不具有免疫刺激作用。CpG基序是CpG DNA产生免疫刺激功能的基本结构，在合成的一段CpG ODN之中，可以有一个基序或者多个CpG基序，CpG基序两侧的嘌呤和嘧啶以及构成不同基序之间的几个碱基，都会影响CpG基序的免疫刺激功能。关于CpG ODN的结构的早期研究显示，CpG基序的免疫作用具有种属特异性，例如对小鼠最有效的CpG基序是5'-GACGTT-3'，而对人最有效的CpG基序是5'-GTCGTT-3'。根据CpG ODN结构和在体外对人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）刺激作用的不同，一般认为把CpG ODN分为3类：A型，B型，和C型。A型CpG ODN能刺激产生大量干扰素α（IFN-α），并能大量激活自然杀伤细胞（natural killer,NK）；B型CpG ODN能够刺激B细胞增殖同时分泌大量免疫球蛋白（Immunoglobulin,IgG）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白介素10（Interleukin-10，IL-10）；C型CpG ODN兼有A型和B型CpG ODN的作用特点。含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN)会被细胞内的Toll样受体9（TLR9)识别，激活Th1免疫应答以加强固有和获得性免疫，一方面，CpG ODN激活TLR9信号诱导了核转录因子和其它细胞内信号途径激活，启动了快速天然免疫反应，包括多种促炎症反应细胞因子及抗病毒细胞因子的分泌，如IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和I型干扰素(IFN)；以及免疫调节细胞因子的分泌，如IL-10，以控制炎症反应的强度，而且，NK细胞和其它天然免疫细胞通过IFN依赖途径或非IFN依赖的途径被间接激活。另一方面，CpG ODN活化的B细胞对抗原刺激的敏感性大大提高，加速分化为分泌抗原特异性抗体的浆细胞，从而促进了获得性免疫应答；CpG ODN激活的pDC向淋巴结和其它次级淋巴组织的T细胞区迁移，表达协同刺激分子水平上调，使其激活初始T细胞和记忆性T细胞的能力增强，并且pDC向CD8T细胞交叉提呈可溶性蛋白抗原的能力增强，强烈促进了依赖Th1途径的CD4和CD8T细胞的免疫应答。CpG目前其作为免疫佐剂在抗病毒和抗肿瘤治疗领域有很广的应用前景。但自从上世界90年代CpG ODN发现具有激活免疫应答的功效至今，却仍然没有一个成熟的CpG药品上市。辉瑞公司的CpG7909停止在临床三期的研究阶段，主要是由于CpG7909在与化药联合使用治疗非小细胞肺癌没有增加疗效，这些失败的案例，体现了现有CpG药物结构上的缺陷。我们的数据表明，普通CpG ODN和常规的在磷酸二酯键骨架上的修饰结构在血清中稳定性还是很差，连接PEG有助于大大提高其血清稳定性。但人们一般认为，并有大量文献支持，PEG修饰会阻碍含PEG的分子与免疫细胞的相互作用，特别是根据文献报道，CpG的受体TLR9主要分布在内吞体内侧，所以PEG修饰的CpG ODN将不再具有免疫活性。但我们通过研究发现，PEG修饰的CpG ODN不仅能作用于B细胞和DC细胞分泌细胞因子，还能提高体内血清中IL-12的浓度，甚至在体内实验中还优于未修饰的CpG。此外，PEG修饰（PEGylation）虽然已经被成功应用于多种蛋白分子以及纳米载药系统的修饰，可以大大提高蛋白的血清稳定性和半衰期，但却几乎很少用来修饰寡核苷酸（ODN）分子，包括siRNA，microRNA，Cpg ODN等，主要原因在于ODN的作用靶点大多在细胞内，经过PEG修饰的ODN分子量更大，进入细胞的效率应该更低。业内更青睐的方法，是利用一些纳米载药系统，来保护ODN的稳定性，提高细胞摄取。但我们发现，对于特定的CpG ODN系列序列修饰PEG，并不会阻滞其进入细胞产生免疫刺激作用，甚至在体内作用中效果还有提高，从而揭示了CpG ODN作为肿瘤治疗药物的新机理和新方向。
技术实现思路
本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术涉及一种PEG修饰的CpG寡核甘酸及其应用。本专利技术涉及PEG修饰的CpG；具有增加体内稳定性及免疫调节功能，能提高在体内对于持续存在的抗原的应答反应。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，第一方面，本专利技术涉及一种PEG修饰的CpG寡核甘酸。优选地，所述PEG的mw≥10K。优选地，所述寡核甘酸的骨架是全硫代修饰、部分硫代修饰或者无硫代修饰的。优选地，所述PEG修饰的位点为5’-末端或者3’-末端。优选地，所述结构为式1或式2所示，所述OLIGO其中的寡核苷酸包含1-5个单位的CpG单元；优选地，所述CpG寡核甘酸的序列为：序列如SEQ ID NO.1所示的CpG-7，序列如SEQ ID NO.2所示的CpG-8,序列如SEQ ID NO.3所示的CpG-13,序列如SEQ ID NO.4所示的CpG1826，序列如SEQ ID NO.5所示的CpG7909，序列如SEQ ID NO.6所示的CpG-H7，序列如SEQ ID NO.7所示的CpG-H8，序列如SEQ ID NO.8所示的CpG-H13，序列如SEQ ID NO.9所示的CpG-H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PEG修饰的CpG寡核甘酸。

【技术特征摘要】
1.一种PEG修饰的CpG寡核甘酸。
2.如权利要求1所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述PEG的mw＞
≥10K。
3.如权利要求1所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述寡核甘酸的
骨架是全硫代修饰、部分硫代修饰或者无硫代修饰的。
4.如权利要求1所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述PEG修饰的
位点为5’-末端或者3’-末端。
5.如权利要求1所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述结构为式1
或式2所示，所述OLIGO其中的寡核苷酸包含1-5个单位的CpG单元；
6.如权利要求1所述的PEG修饰的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述CpG寡核甘
酸的序列为：
序列如SEQ ID NO.1所示的CpG-7，
序列如SEQ ID NO.2所示的CpG-8,
序列如SEQ ID NO.3所示的CpG-13,
序列如SEQ ID NO.4所示的CpG1826，
序列如SEQ ID NO.5所示的CpG7909，
序列如SEQ ID NO.6所示的CpG-H7，
序列如SEQ ID NO.7所示的CpG-H8，
序列如SEQ ID NO.8所示的CpG-H13，
序列如SEQ ID NO.9所示的CpG-H1826。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宇虹，向小飞，岳洋，吴彩兴，王辉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31