【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶、制备方法及应用。
技术介绍
1、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种革兰氏阳性致病菌，能引起许多疾病，甚至危及生命。其中，食源性金黄色葡萄球菌会引起食物中毒和感染，使人产生呕吐或腹泻的症状。在食品制备和加工过程中，食源性金黄色葡萄球菌会污染食品，常见于肉类和肉制品、牛奶和乳制品中。
2、青霉素的出现使得由金黄色葡萄球菌引起的传染病在当时得到了较好的控制，但随着青霉素的广泛使用，临床上出现了耐青霉素的金黄色葡萄球菌。此后虽然有新的抗生素类药物出现，但由于抗生素的广泛使用，使细菌耐药性危机不断升级，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistants.aureus,mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌，以及多重耐药金黄色葡萄球菌，对公众健康造成了严重的威胁。因此，研究开发新型抗菌剂以对抗金黄色葡萄球菌造成的感染十分必要。
3、噬菌体裂解酶以其高效、安全、不易使细菌产生耐药性且结构易于改造等优点成为了有潜力的抗菌药物。大多数感染金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解酶由酶活性结构域(enzymatic activity domain,ead)和细胞壁结合结构域(cell wall binding domain,cbd)两部分组成。ead由n端的肽内切酶，即半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(cysteine-,histidine-dependent amidohydrolase/peptida
4、目前对金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的研究主要集中于适应中性或弱酸性环境的裂解酶，且大多数都为天然裂解酶，裂解活性不高，对于高效耐碱性裂解酶的研究较少。因此，通过重组结构域的方法开发出耐受碱性环境、高裂解活性的裂解酶已成为本领域亟待解决的难题。
5、因此，本领域的技术人员致力于开发一种新型的耐受碱性环境、高裂解活性的细菌裂解酶。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新型的耐受碱性环境、高裂解活性的细菌裂解酶。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶，其特征在于，所述裂解酶为salcd，氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq idno.2所示。
3、本专利技术还提供前述的耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4、步骤1、对chap结构域与cbd结构域分别设计引物以人工合成的序列seq id no.2为模版进行扩增，获得salcd-chap、salcd-cbd基因片段，salcd-chap、salcd-cbd基因片段的序列分别如seq id no.7、seq id no.8所示；
5、步骤2、按照n端为chap结构域，c端为cbd结构域的顺序将步骤1中的基因片段克隆至表达质粒中，获得含有salcd的表达质粒，将其转化入表达菌株中；
6、步骤3、对步骤2中获得的菌株进行诱导表达及纯化，获得删除酰胺酶结构域的截短裂解酶salcd。
7、在本专利技术的较佳实施方式中，所述步骤1中的引物序列如下：
8、seq id no.3
9、sal-chap-f:ctttaagaaggagatataccatggctaagactcaagcagaa；
10、seq id no.4
11、sal-chap-r:ttttccaagaattcttagaaacttttagtgttgct；
12、seq id no.5
13、sal-cbd-f:ttctaagaattcttggaaaaagaaccagtac；
14、seq id no.6
15、sal-cbd-r:cagtggtggtggtggtggtgtttgaatactccccaggc。
16、在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤2和步骤3具体包括：
17、步骤2.1、将步骤1中获得的基因片段与经ncoⅰ和xhoⅰ双酶切后的pet28a质粒进行切胶回收，将基因片段与质粒加入无缝克隆体系反应；
18、步骤2.2、将无缝克隆产物转化入e.coli dh5α感受态细胞中，将菌液涂布在含有卡那霉素的lb平板上培养后，接种至含卡那霉素的lb肉汤中培养，提取质粒，即salcd的重组表达质粒；
19、步骤2.3、将获得的重组表达质粒转化入e.coli bl21感受态中，将菌液涂布在含卡那霉素的lb平板上培养后，接种至含卡那霉素的lb肉汤中培养，并保藏菌液；
20、步骤3.1、活化培养步骤2.3中获得的菌株，随后转接培养，加入iptg诱导表达；
21、步骤3.2、离心收集菌体，洗涤后，按比例加入裂解液裂解，待菌液澄清透明后离心，分离上清沉淀；
22、步骤3.3、使用滤膜过滤细菌破碎上清液，以此为样品，使用ni-nta预装重力柱进行裂解酶纯化，在每一步骤中控制柱中存在的液体体积一致，保证压力一致，液体流速一致，对样品流穿液、流洗液、洗脱液进行sds-page检测，确定目的蛋白有单一条带的洗脱浓度，收集该浓度洗脱液进行超滤浓缩后，置于-80℃冻存。
23、本专利技术还提供上述耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶的应用。
24、在本专利技术的较佳实施方式中，所述裂解酶在ph 8.0-11.0下使用。
25、在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述裂解酶在室温下使用。
26、在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述裂解酶用于控制多种金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌，所述其他葡萄球菌包括头葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、小牛肉葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
27、在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述裂解酶在有活性辅助因子时使用，所述活性辅助因子为ca2+或mg2+。
28、在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述裂解酶应用于食品加工行业，作为喷剂直接使用，或通过ph敏感的脂质体封装在碱性环境下触发释放。
29、技术效果
30、1、本专利技术提供的一种高效耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶结构简单，分子量为32.2kd。
31、2、本专利技术通过结构域重组改变裂解酶的性质，使得salcd的碱性环境耐受性更强，最适ph为11.0，且保持高活性的范围较广，在ph 9.0-11.0的环境下相对活性在80％以上，salcd可以应用于碱性环境中，如食品加工行业中，可作为喷剂直接使用，或通过ph敏感的脂质体封装在碱性环境下触发释放；本专利技术提供的高效耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶，其特征在于，所述裂解酶为SALcd，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的引物序列如下：
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3具体包括：
5.如权利要求1所述耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述裂解酶在pH 8.0-11.0下使用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述裂解酶在室温下使用。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述裂解酶用于控制多种金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌，所述其他葡萄球菌包括头葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、小牛肉葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述裂解酶在有活性辅助因子时使用，所述活性辅助因子为Ca2
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述裂解酶应用于食品加工行业，作为喷剂直接使用，或通过pH敏感的脂质体封装在碱性环境下触发释放。
...【技术特征摘要】
1.一种耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶，其特征在于，所述裂解酶为salcd，氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.一种如权利要求1所述的耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的引物序列如下：
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3具体包括：
5.如权利要求1所述耐碱性金黄色葡萄球菌噬菌体重组裂解酶的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，...
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