治疗突变引起的疾病的方法和化合物技术

本发明专利技术涉及具有２’－脱氧核糖核苷酸和核糖苷酸的双链体寡核苷酸的用途，其中在两种类型的核苷酸间形成碱基对。选择所述寡核苷酸的序列，使得所述寡核苷酸的３’和５’的大多数区与预先选定细胞的靶基因序列同源（相同）。同源的两个区包含一个与靶序列异源的区。将所述寡核苷酸引入细胞引起靶基因改变，使得改变的靶基因序列是异源区的序列。所述本发明专利技术的寡核酸被称为嵌合突变载体（ＣＭＶ）。在本发明专利技术的一个实施方案中，所述靶基因是珠蛋白基因，所述靶细胞是造血干细胞。该实施方案可以用于校正某些血红蛋白病，诸如镰刀形细胞病、β－地中海贫血病和高歇氏病。珠蛋白基因的校正率足够高，以致不需选择处理的造血干细胞，则获得显著的治疗效果。在一个实施方案中，所述ＣＭＶ的核糖核苷酸含有甲基化的２’－Ｏ。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
Ⅰ．专利
本专利技术的领域涉及突变引起的疾病的治疗，所述突变引起造血细胞或可从受治疗者人体取出、培养和再植入的其它类型细胞中的突变基因的异常水平或异常产物。通过突变基因和嵌合修复载体(CRV)的同源重组使病人突变基因配对实现治疗，CRV是既有脱氧核糖核苷酸又有核糖核苷酸的核酸。更详细地讲，该领域涉及引起镰刀形红细胞病、β-地中海贫血和高歇氏病的突变的修复。Ⅱ．专利技术背景A．造血细胞表达基因的突变引起的疾病及其用骨髓移植的治疗1．血红蛋白病和高歇氏病已知有500多种血红蛋白的结构变异体。有变异血红蛋白的许多人是无症状的或是只有轻微的影响。三个常见的变异体就和重要的疾病有关。HbS(镰状细胞性贫血红蛋白)和HbC两种血红蛋白是编码β-珠蛋白Glu6的密码子中发生了点突变，这两种珠蛋白在非洲人及其后裔中有发现。HbC是由于第6个密码子的第一位发生G→A的置换，而HbS则是由于第6个密码子的第二位发生了A→T置换，分别产生了Lys6和Val6。与疾病有关的血红蛋白的第三种常见的变异体HbE，是由于编码Glu26的第26个密码子的第一位置发生了G→A的置换，结果产生了Lys26，HbE最初是在东南亚人群及其后裔中发现的。HbS、HbC或HbE杂合的人没有明显的病症。然而，HbS纯合体、HbS/HbC杂合体及HbC或HbE与β-地中海贫血病的等位基因的杂合体就有严重影响，并需经常的医疗照顾。地中海贫血是一类血红蛋白病，其中α-珠蛋白与β-珠蛋白合成速度不均衡。地中海贫血病根据突变基因可分为α或β型，并根据受影响蛋白是完全还原还是部分还原分为例如α0和β0(完全还原)或者如α+和β+(部分还原)。在单倍体人类基因组中有两个紧密相连的功能α-珠蛋白基因。α-地中海贫血病的最普遍的原因是相连的α-珠蛋白基因或者α-珠蛋白基因座控制区发生了缺失或重排。相反，β-地中海贫血病的普遍原因是点突变。最普遍原因是β-珠蛋白基因110位发生G→A置换，在第一个内含子(IVSI)中产生一个新的剪接接受位点。已经特征记述了大约100种不同类型的β-地中海贫血病。已描述特性的突变中只有14种是显性的，即与野生型β-珠蛋白等位基因杂合时引起显著的临床病况。其余的突变与第二个β-地中海贫血病基因纯合或杂合时导致严重的临床病况，称为重型地中海贫血病。血红蛋白病的详细综述见Weatherall等著的《遗传病的新陈代谢和分子基础》(THE METABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITEDDESEASE)第七版第113章(McGraw-Hill，纽约，1995)。高歇氏病是溶酶体糖脂贮积病。有三种公认的类型。1型高歇氏病在阿什哈巴德(东欧)的犹太人及其后裔中最普遍；2型是panethinc；3型在瑞典北部最普遍。高歇氏病的病因是葡糖脑苷酯酶有缺陷，该酶也叫酸性葡糖苷酶。葡糖脑苷脂酶在源于骨髓的巨噬细胞/单核白细胞的细胞类型中表达。有三种不同的引起高歇氏病的常见突变mRNA的第1225位核苷酸发生A→G的置换，导致葡糖脑苷脂酶第370位残基发生Asn→Ser的置换(N370S突变)；mRNA第1448位核苷酸发生T→C置换，导致葡糖脑苷脂酶第444残基发生Leu→Pro置换(L444P突变)；及第位核苷酸G的重复导致移码突变(84GG突变)。N370S和84GG突变与阿什哈巴德人群有关，而L444P突变与瑞典北部人群有关且是偶尔发生的突变。引起高歇氏病的编码序列的不常见但并不罕见的突变已鉴定如下于754位T→C；于1192位，C→T；于1193位，G→A；于1297位，G→T；于1342位，G→C；于1504位，C→T；及于1604位，G→A。引起高歇氏病的突变是隐性的，即有一个野生型葡糖脑苷脂酶等位基因的个体没有症状。N370S突变纯合的个体通常在其生命晚期发展成轻微的病。相反，L444P突变的纯合个体患有比较严重的2型和3型高歇氏病。84GG突变在纯合状态时导致产物没有酶活性，且导致严重的临床疾病。在不常见的突变中，于核苷酸754、1192、1297和1342的突变与严重形式的疾病相关。高歇氏病的详细综述见Beutler,E.和Grabowski《遗传疾病的新陈代谢和分子基础》(THEMETABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DESEASE)第7版、第86章(McGraw-Hill，纽约，1995)。2．通过骨髓移植治疗突变引起的疾病通过HLA匹配的具有正常β-珠蛋白基因的骨髓的同种异体骨髓移植治疗严重的β-地中海贫血的病例已报道是有临床益处的。Giardini,C等，1995,Annu.Rve.Med.46:319-30(地中海贫血病)；Lucarelli,G等，1991,Hematol.Oncoi.Clin.North Am.5:549(地中海贫血病)；Kalinyak,K.A等1995,Am.J.of Hemat.48:256-61(镰刀形细胞)；Abboud,M.R.等1994,Am.J.ofPed.Hem/Onc 16:86-89(镰刀形细胞)；Kirkpatrick,D.V等1991,Semi.Hematol.28:240(镰刀形细胞)。临床结果显示移入成功时是有疗效的。移入可以是持久的；有报导在随后的3-8年中没有发现排斥作用。然而，由于移植物抗宿主病的发展和如环孢菌素的免疫抑制药物的维持剂量，失败的比率是明显的。获得HLA匹配的骨髓也可能有相当的困难。治疗1型高歇氏病的同种异体骨髓移植已产生了与上述地中海贫血病大致相同的结果。Ringden,O.等1995,Transplantation 59:864)；Chan,K.W.等1994,Bone Marrow Transplantation 14:327。骨髓移植用于治疗更严重的涉及中枢神经系统的2型和3型高歇氏病据报道也已获得满意的结果。Tsai,P.等1992,Pediatr.Res.31:503；Svennerholm,L.等1991,Dev.Neurosci.13:345-51。与珠蛋白基因相对比，用病毒表达载体可以获得有效水平的葡糖脑苷脂酶表达，这就提示转导骨髓的自体移植对高歇氏病是有效的疗法。Karlsson,S.和Correll,P.H.,1993,Bone Marrow Transplantation 11(增刊11):124-7。B．具DNA·RNA碱基对的嵌合寡核苷酸具有互补脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸并含与噬菌体M13mp19的片段同源序列的寡核苷酸，在Kmiec.E.等1994年11月Mol.and Cell.Biol.14:7163-7172中有描述。该寡核苷酸有单一相邻的核苷酸区段。Kmies等指出，该寡核苷酸是源于玉蜀黍黑粉菌的REC2同源配对酶的底物。1995年6月15日公布的并为相应的于1994年12月9日提交的美国专利申请序号08/353,657的专利说明书WO 95/15972，描述了在原核细胞中引进遗传改变的嵌合修复载体(CRV)。在玉蜀黍黑粉菌基因和鼠ras基因中已有实例报道。后一例子设计用来把转化突变引入到ras基因，使得ras基因在NIH 373细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
最多具有一个３’端和一个５’端的核酸，它具有一个未配对碱基的区段，该区段的配置使得所述未配对碱基将该核酸分成了第一条链和第二条链，所述第一条链和第二条链分别包含第一区和第二区，每个区有至少１５个核苷酸，其中：（ａ）所述第一区的每个核苷酸 与所述第二区的一个核苷酸是Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ配对的；（ｂ）第一区包含至少８个核糖核苷酸，与２’－脱氧核苷酸是Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ配对的，这些核糖核苷酸形成至少一个核糖核苷酸区段，所述区段至少有３个核糖核苷酸。（ｃ）所述第一 区或所述第二区的序列是人类基因野生型等位基因片段的序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：EB克米埃克，A科勒斯特劳斯，K尤恩，
申请(专利权)人：托马斯杰弗逊大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]