检测EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了检测EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％EGFR基因突变的DNA样本，本发明专利技术的检测方法对EGFR基因突变检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，特别适合从血浆，尿液，唾液等含有突变含量低的体液中检测基因突变，适合对肺癌进行早期筛查和诊断，为个体化用药提供指导。

【技术实现步骤摘要】
检测EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及检测EGFR基因突变的试剂盒，该涉及利用该试剂盒在非疾病诊断中检测EGFR基因突变的方法。
技术介绍
表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，定位于细胞膜上，一种跨膜受体酪氨酸激酶。EGFR主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras→Raf→MAPK途径；另一条是PI3K→PKC→IKK途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer，NSCLC)临床治疗的重要手段。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗疗效相关，多数携带EGFR基因突变的患者疗效显著。临床研究证实，18-21外显子突变可作为TKI治疗的有效预测指标。各种来源的肺癌组织是检测突变的最佳样本，但部分中晚期患者难以得到较佳的病理组织，检测血液中来自肿瘤的DNA是否有突变是一种趋势。肿瘤患者的血液循环DNA，亦称非细胞游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)中包含肿瘤起源的DNA。肿瘤cfDNA包括来源于正常细胞的野生型DNA和肿瘤细胞DNA，多项研究表明肿瘤患者血液中可以检测到与自身肿瘤相一致的DNA突变。因此，检测组织或血液EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药，具有重要的参考价值。目前检测基因突变的方法主要有以下几种：(1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计引物(每个基因设计一对引物，引物所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。(2)变性高效液相色谱法(denaturinghigh-performanceliquidchromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“Y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。(3)高分辨率溶解曲线(highresolutionmelting，HRM)。高分辨率溶解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。(4)探针扩增阻滞突变法(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物,该检测方法的灵敏度在1％左右。(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(competitiveallele-specificTaqManpolymerasechainreaction，CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1-0.1％左右。因此，急需一种提高检测EGFR基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为肺癌个体化用药提供指导。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供检测EGFR基因突变的试剂盒，该试剂盒特异性强且灵敏度高；本专利技术的目的之二在于提供检测EGFR基因突变，该方法检测周期短。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、检测EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的Block序列。优选的，所述LNA锁核酸修饰的Block序列如下：G719X：CC+GGAG+C+CCAGCACTTTG-PO4；19-del：TA+TCAAGGAATTA+A+GA+GAAGCAACATCTC-PO4；20-Insertions：GGACAAC+CC+CCAC+G+TGTGC-PO4；T790M：AT+CA+C+G+C+AGCTCATGCC-PO4；S768I：GG+C+CA+GCG+TGGACAACCC-PO4；L858R：GG+GC+T+GG+CC+AAACTGCTG-PO4；L861Q：AC+T+G+CTG+GG+TGCGGAAGAGAAAG-PO4；其中“+”后的T，A，C或G表示锁核酸修饰碱基。优选的，所述试剂盒中还包含检测EGFR基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2、SEQIDNO.1与SEQIDNO.3、SEQIDNO.1与SEQIDNO.4、SEQIDNO.5与SEQIDNO.24、SEQIDNO.6与SEQIDNO.24、SEQIDNO.7与SEQIDNO.24、SEQIDNO.8与SEQIDNO.24、SEQIDNO.9与SEQIDNO.24、SEQIDNO.10与SEQIDNO.24、SEQIDNO.11与SEQIDNO.24、SEQIDNO.12与SEQIDNO.24、SEQIDNO.13与SEQIDNO.24、SEQIDNO.14与SEQIDNO.24、SEQIDNO.15与SEQIDNO.24、SEQIDNO.16与SEQIDNO.24、SEQIDNO.17与SEQIDNO.24、SEQIDNO.18与SEQIDNO.24、SEQIDNO.19与SEQIDNO.24、SEQIDNO.20与SEQIDNO.24、SEQIDNO.本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的Block序列。

【技术特征摘要】
1.检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的Block序列和检测EGFR基因突变的引物；所述LNA锁核酸修饰的Block序列如下：G719X：CC+GGAG+C+CCAGCACTTTG-PO4；19-del：TA+TCAAGGAATTA+A+GA+GAAGCAACATCTC-PO4；20-Insertions：GGACAAC+CC+CCAC+G+TGTGC-PO4；T790M：AT+CA+C+G+C+AGCTCATGCC-PO4；S768I：GG+C+CA+GCG+TGGACAACCC-PO4；L858R：GG+GC+T+GG+CC+AAACTGCTG-PO4；L861Q：AC+T+G+CTG+GG+TGCGGAAGAGAAAG-PO4；其中“+”后的T，A，C或G表示锁核酸修饰碱基；所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2、SEQIDNO.1与SEQIDNO.3、SEQIDNO.1与SEQIDNO.4、SEQIDNO.5与SEQIDNO.24、SEQIDNO.6与SEQIDNO.24、SEQIDNO.7与SEQIDNO.24、SEQIDNO.8与SEQIDNO.24、SEQIDNO.9与SEQIDNO.24、SEQIDNO.10与SEQIDNO.24、SEQIDNO.11与SEQIDNO.24、SEQIDNO.12与SEQIDNO.24、SEQIDNO.13与SEQIDNO.24、SEQIDNO.14与SEQIDNO.24、SEQIDNO.15与SEQIDNO.24、SEQIDNO.16与SEQIDNO.24、SEQIDNO.17与SEQIDNO.24、SEQIDNO.18与SEQIDNO.24、SEQIDNO.19与SEQIDNO.24、SEQIDNO.20与SEQIDNO.24、SEQIDNO.21与SEQIDNO.24、SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，李宗飞，孙爱娟，李杰，张丽，
申请(专利权)人：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32