一种检测MPL基因突变的引物与方法技术

本发明专利技术提供一种检测MPL基因突变的引物，包括针对MPL基因外显子10的上游引物和下游引物。本发明专利技术属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供的引物可以实现MPL基因外显子10突变的特异性检测，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，尤其设及一种检测MI^L基因突变的引物与方法。
技术介绍
骨髓增值性肿瘤（MPN)是由造血前体细胞生长激活基因改变导致的多细胞系过度 增殖而引起的，包括真性红细胞增多症（PV)、原发性血小板增多症（ET)和原发性骨髓纤维 化（PMF)。骨髓增值性肿瘤若不及时治疗，最终可能发展呈急性粒细胞性白血病。MI^L基因 编码人血小板生成素受体（TPOR)，促进细胞的生长、增殖及分化。人血小板生成素受体参与 调控巨核细胞的增殖与血小板的生成，对造血干细胞的维护起着重要的作用。MI^L基因跨膜 区域的体细胞突变首先由Pikman等在JAK2V617F突变阴性的PMF患者中发现，被认为与 JAK2V617F突变阴性的MPN患者中JAK-STAT信号转导通路发生持续性激活有关。 现有研究表明，MI^L基因突变主要发生在外显子10第515位密码子上（W5巧L, W515K，W515R和W515A)，约 8. 5% 的JAK2V617F突变阴性的ET和约 15% 的JAK2V617F突 变阴性的PMF患者可检测到MPL基因突变，但在PV患者中未发现MPL基因突变。MPLW515 突变是JAK2V617F阴性的MPN患者的致病因素之一。 中国专利申请201210374903. 7公开了一种检测MPL基因W515位点突变的试剂 盒，该试剂盒包括位点突变特异性引物、内参基因ABL引物和巧光探针等，用于MI^L基因 W515位点突变的检测存在存在反应体系复杂，需要多种引物和巧光定量PCR仪的缺点。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测M化基因突变的引物与方 法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测MI^L基因外显子10突变的准确检 测。 本专利技术提供一种检测M化基因突变的引物，包括针对M化基因外显子10的上游引 物TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAACAGCTATG ACCGATCTGGGGTCACAGAGCGA(沈QIDNO. 2)。 优选地，所述引物中，外显子10的上游引物和外显子10的下游引物浓度比为1: Io 相应地，本专利技术还提供一种检测M化基因突变的方法，包括如下步骤:A)提取DNA 样品；B)采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C)对扩增产物进行凝胶电泳分 析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :98°CSmin;阶段2 :98°C 1〇3;阶段3:631：3〇3;阶段4:72°(：1111111;阶段5:返回到阶段2,34个循环；阶段6:721： Smin;阶段7 :25 °C保溫。 优选地，所述步骤C)中，采用Sequencher4. 1. 4软件对检测结果进行分析。[001引此外，本专利技术还提供检测M化基因突变的引物在制备检测M化基因突变试剂中的 用途。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测MI^L基因外显子 10突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本专利技术还提供了一种 检测MI^L基因外显子10突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准 确性好等优点，可作为JAK2V617F阴性的ET和PMF患者的辅助检测方法，进而为其临床用 药提供指导。【附图说明】 图1本专利技术提供的MPL基因外显子10引物的扩增片段。 阳01引图2PCR扩增产物的凝胶电泳图。图3 MPL基因外显子10野生型的部分测序图。 阳017] 图4 MPL基因外显子10突变型的部分测序图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。 实施例一引物 专利技术人针对MI^L基因外显子10,设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛 选出了特异性好的引物。实施例二引物的特异性 将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting,MI^L基因外显子10引物扩增片段位于C虹1: 43814796-43815124间，长度为329bp。无其它同源基因，结果如图1所示，与MPL 基因参考序列相符。[OOW使用表1中的引物、表2中的PCR扩增体系和表3的PCR扩增条件对检测样品进 行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示。结果显示，扩增产物的特异性高， 无非特异性扩增条带产生。 阳02引实施例SM化基因外显子10突变的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购自Tiagen,货号：DP318)的说明书，将DNA样品稀释至l(K)ng/iiL备用。 阳02引 PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购自肥B公司，货号：M049化）， PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。外显子10的上游引物和外显子10的 下游引物浓度比为1 :1，外显子10的上游引物浓度和外显子10的下游引物浓度都为IOp/ mol O对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示。结果显示，扩增产物的特异性高， 无非特异性扩增条带产生。采用Bi曲ye? Terminator v3.1(购自Life司，货号4336919) 对检测样品的PCR扩增产物进行Sanger测序，Sanger测序的操作步骤如下： A)DNA测序模板处理，加入ExoSAP-口酶，在ABI9700PCR仪中，按W下程序进行处理： 37 °C，15min;80 °C，15min;4°C，infinite。B)参考Bi曲ye?Terminatorv3.I切cleSequencingKit操作说明制备测序PCR体系。 C)在ABI9700PCR仪中，按W下程序进行处理： 96°C，1min-（96°C，10S- 50°C，5S- 60°C，4min)，25 个循环一 4°C保溫。 D)用酒精/EDTA/NaAc法对测序PCR的产物进行纯化。 巧室溫挥发净酒精，加入IOyL化-Di化rmamide溶解DNA，溶解后的样品需要在 95°C变性4 min,迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。 测序结果(仅显示部分）如图3至图4所示，扩增产物的序列与参考序列相符。 实施例四检测M化基因外显子10突变的方法的准确性 本检测准确性定义为不同引物检测结果的一致性。 本检测方法使用表1中的检测引物对22例血液样品DNA进行检测，此外，使用表 4中的验证引物对22例血液样品DNA进行检测，结果如表5所示。22例样品经两套不同引 物检测，检测结果一致，表明本检测方法的准确性为100%。注：NMD即未检测到突变。[003引实施例五检测M化基因外显子10突变的方法的特异性和灵敏度 本检测的检测特异性定义为阴性符合率，检测灵敏度定义为阳性符合率。 本检测方法使用表1中的检测引物对22例血液样品DNA进行检测，此外，使用表 4中的验证引物对22例血液样品DNA进行检测，结果如表5所示。检测引物和验证引物检 测结果为阴性（未检测到突变）的样品完全一致，本检测方法的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测MPL基因突变的引物，其特征在于：包括针对MPL基因外显子10的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCGATCTGGGGTCACAGAGCGA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：燕启江，赵薇薇，于世辉，梁耀铭，胡昌明，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44