一种检测JAK2 V617F基因突变的引物及其方法技术

本发明专利技术公布了一种检测JAK2V617F基因突变的引物，其中引物包括用于扩增JAK2V617F的正常序列内引物JAK2WF、突变序列内引物JAK2MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2WR、封闭引物JAK2WF‑P，并将该引物对JAK2V617F基因突变列进行荧光定量PCR反应。本发明专利技术所述的JAK2V617F基因突变的检测方法相对于现有技术的检测方法检测灵敏度提高，远远高于20％，且检测方法简单，成本低廉，报告周期短，适用于一般筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因检测方法，具体涉及一种检测JAK2 V617F基因突变的引物及其方法。
技术介绍
骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative Disorder，MPD)是一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，其中以真性红细胞增多症(Polycythemia Vera，PV)、原发性血小板增多症(Essential Thrombocythemia，ET)、骨髓纤维化(Myelofibrosis，MF)最为常见。JAK2与JAK1、JAK3和TYK2同属于JAK家属，为非受体型即细胞内激酶。V617F突变位于JAK2的JH2假激酶区，此与该激酶活性的抑制有关。V617F突变导致JAK2持续激活，导致不受控制的细胞持续增殖从而导致MPD的发生。世界卫生组织于2008年将JAK2 V617F基因突变列为骨髓增殖性疾病的主要确诊指标之一。JAK2(Janus Tyrosine Kinase 2)V617F基因突变常见于PV、MF和ET中。目前的研究报道表明，JAK2 V617F(c.1849G>T)的突变率在PV中约为65％～97％、ET中约为23％～57％、MF中约为35％～57％。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：现有JAK2 V617F基因突变序列的检测方法是测序和定量PCR，测序检测灵敏度低，检测下限只有20％，而定量PCR检测，需要采用特定的实验仪器，检测成本高。 现提供一种检测JAK2 V617F基因突变的引物及其方法。解决了现有检测方法检测灵敏度低、准确度低等技术缺陷。本专利技术的通过下述技术方案实现：一种检测JAK2 V617F基因突变的引物，包括用于扩增JAK2 V617F的正常序列内引物JAK2 WF、突变序列内引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引物JAK2 WF-P，各引物的核苷酸序列为：JAK2 WF：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTGJAK2 MF：GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGATJAK2 WR:ACTGACACCTAGCTGTGATCCTGJAK2 WF-P：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。现有的对于JAK2 V617F基因突变的检测方法是直接测序和定量PCR，测序是指直接对JAK2 V617F的某一段进行测序，确定突变点，该检测方法灵敏度低，检测下限不超过20％。专利技术人经过大量实验研究设计：引物JAK2 WF，用于对正常序列JAK2 V617F进行扩增，并作为内参。引物JAK2 MF，针对突变序 列(G>T)，由于将最后碱基G换成T造成正常序列里没有突变基因也会扩增，故将jak2 MF的最后两个碱基进行改变，该突变序列的内引物JAK2 MF可高度特异性扩增突变序列。反向引物JAK2 WR为正常序列和突变序列共用。封闭引物JAK2 WF-P的采用，可进一步增加检测的灵敏度，该封闭引物在突变反应体系中特异性的封闭正常序列，从而使突变序列获得更好的扩增。如此突变序列的引物就可特异性的扩增突变序列，正常序列中则不会出现突变条带。本专利技术技术方案中封闭引物JAK2 WF-P加入到正常序列中，能结合没有突变的序列，从而使检测体系中突变序列扩增比例相对增高，提高整个检测的灵敏度和准确度。本专利技术还提供了一种JAK2 V617F基因突变的检测方法，包括以下步骤：1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA；2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的正常序列内引物JAK2 WF、突变序列内引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引物JAK2 WF-P进行扩增；3)对步骤2)的扩增反应获得的扩增条带，分别进行测序。进一步地，为了更好的实现本专利技术，所述扩增方法为PCR扩增。进一步地，为了更好的实现本专利技术，PCR扩增反应具体操作方法为：1)将检测样本DNA稀释至100ug/ml；2)在PCR反应管中加入ddH2O、Taq PCR Mastermix、引物工作液制备PCR反应体系，离心；3)在PCR反应管中加入检测样本后稀释至100ng/μL样本DNA模板；4)震荡混匀，转移至PCR仪上进行扩增反应。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本专利技术在检测突变序列中加入正常序列的封闭引物jak2 WF-P，该封闭引物能结合没有突变的序列，从而使检测突变体系中突变序列的比例相对增高，从而提高检测JAK2 V617F基因突变的灵敏度和准确度。(2)本专利技术所采用的检测方法相对于一般的采用定量PCR和测序方法不同，本专利技术引入竞争性抑制物封闭引物，可提高检测灵敏度高于20％，满足初诊患者，成本低，且本专利技术所述的检测方法操作简单、成本低廉、报告周期短、适用于一般筛查。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为本专利技术实施例1中阳性样本a管的扩增条带图；图2为本专利技术实施例1中阳性样本b管的扩增条带图；图3为本专利技术实施例1中灵敏度检测结果图；图4为本专利技术实施例1中野生型序列扩增结果图；图5为本专利技术实施例1中突变型序列扩增结果图；图6为本专利技术检测JAK2 V617F基因突变方法的结构示意框图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。实施例1：一种检测JAK2 V617F基因突变的引物，包括用于扩增JAK2 V617F的正常序列引物JAK2 WF、突变序列引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引物JAK2 WF-P，各引物的核苷酸序列为：JAK2 WF：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTGJAK2 MF：GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGATJAK2 WR：ACTGACACCTAGCTGTGATCCTGJAK2 WF-P：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。其中，正常序列的封闭引物JAK2 WF-P，加入到检测突变的体系中，该封闭引物能结合没有突变的序列，而从使体系中突变序列相 对比例相对增高，从而提高检测的灵敏度和准确度。一种JAK2 V617F基因突变的检测方法：将实施例1中的引物序列对JAK2 V617F基因突变列进行PCR扩增反应。本实施例所述的检测方法主要检测JAK2编码序列的1849位点上由G到T的突变。因而在设计引物时，采用的对照就是没有突变的序列：GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG，而JAK2突变序列中由序列最后一位的G变成T，我们在设计突变引物时，把最后两个碱基都换掉，序列为：GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT，此引物可特异的扩增出突变基因。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测JAK2V617F基因突变的引物，其特征在于：包括用于扩增JAK2V617F的正常序列内引物JAK2WF、突变序列内引物JAK2MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2WR、封闭引物JAK2WF‑P，各引物的核苷酸序列为：JAK2WF：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTGJAK2MF：GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGATJAK2WR：ACTGACACCTAGCTGTGATCCTGJAK2WF‑P：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG‑P。

【技术特征摘要】
1.一种检测JAK2V617F基因突变的引物，其特征在于：包括用于扩增JAK2V617F的正常序列内引物JAK2WF、突变序列内引物JAK2MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2WR、封闭引物JAK2WF-P，各引物的核苷酸序列为：JAK2WF：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTGJAK2MF：GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGATJAK2WR：ACTGACACCTAGCTGTGATCCTGJAK2WF-P：ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。2.一种JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA；2)以受...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄平，周炜，欧阳小峰，彭宇，
申请(专利权)人：四川金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51