将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法技术

本发明专利技术涉及将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的新方法。本发明专利技术还涉及表征靶多核苷酸的新方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的新方法。本专利技术还涉及表征靶多核苷酸的新方法。
技术介绍
目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。当跨纳米孔施加电势时，在，当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
技术实现思路
令人惊讶地，专利技术人已经证明可以预装载一个或多个多核苷酸结合蛋白到一个或多个装载部分，然后连接所述一个或多个装载部分到所述靶多核苷酸。令人惊讶的是，所述一个或多个多核苷酸结合蛋白对所述一个或多个装载部分到多核苷酸的连接没有空间位阻。还令人惊讶的是，连接过程不影响所述一个或多个多核苷酸结合蛋白，且所述一个或多个多核酸结合蛋白在连接到靶多核苷酸后仍保留其结合到所述一个或多个装载部分的给功能和能力。因此，本专利技术提供了一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法，包括：(a)提供结合到一个或多个装载部分的一个或多个多核苷酸结合蛋白；和(b)将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。本专利技术还提供了表征靶多核苷酸的方法，包括：(a)实施本专利技术所述的方法；(b)将在步骤(a)中提供的连接有一个或多个多核苷酸结合蛋白的靶多核苷酸与跨膜孔接触，以使得所述一个或多个多核苷酸结合蛋白控制所述多核苷酸相对于所述孔的移动；和(c)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述靶多核苷酸。本专利技术还提供了一种制备用于表征的靶多核苷酸的方法，包括：(a)实施本专利技术的方法，其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白包含一个或多个聚合酶；和(a)使用所述靶多核苷酸作为模板，使得在步骤(a)中提供的连接到所述靶多核苷酸的所述一个或多个聚合酶形成一个或多个多核苷酸，并由此制备用于表征的所述靶多核苷酸。本专利技术还提供一种表征靶多核苷酸的方法，包括：(a)实施本专利技术所述的基于聚合酶的方法；(b)将在步骤(a)中产生的所述靶多核苷酸及所述一个或多个多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述靶多核苷酸及所述一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动；和(c)随着所述靶多核苷酸和所述一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述靶多核苷酸。本专利技术还提供：-使用本专利技术所述的方法修饰的靶多核苷酸；-具有一个或多个所结合的多核苷酸结合蛋白的装载部分；和-用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的试剂盒，包含(a)结合到一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白；和(b)连接酶。附图说明图1示出了使用8mL POROS HQ-10柱将预结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C纯化后的示例性FPLC轨迹。图2示出了使用5mL Histrap HP柱将预结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C纯化后的示例性FPLC轨迹。图3示出了TBE(天然的)PAGE凝胶分析(DNA校准带对应在凝胶的顶部示出的DNA浓度)，柱1示出了在只有缓冲液中结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C(显示为条带X)，柱2示出了添加TRIS缓冲液后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C，柱3示出了添加双马来酰亚胺基乙烷后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C，柱4-6示出了经两次FPLC纯化后结合到DNA发夹衔体的不同稀释浓度的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C。条带X对应结合到DNA的酶。条带Y对应没有酶结合的DNA。图4示出了SDS PAGE凝胶分析(DNA校准带对应在凝胶的顶部示出的DNA浓度)，柱1示出了在只有缓冲液中结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C(显示为条带X)，柱2示出了添加TRIS缓冲液后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C，柱3示出了添加双马来酰亚胺基乙烷后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C，柱4-6示出了经两次FPLC纯化后结合到DNA发夹衔体的不同稀释浓度的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C。条带Y对应DNA上没有闭合的酶。条带X对应由双马来酰亚胺基乙烷连接体结合到DNA上的酶。图5示出了TBE(天然的)PAGE凝胶分析(DNA校准带对应在凝胶的顶部显示的DNA浓度)，柱1示出了在添加TMAD前结合到DNA发夹衔体的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C。柱2示出了添加KCl和ATP之后结合到DNA发夹衔体的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C，柱3示出了SPRI纯化后结合到DNA发夹衔体的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C。条带2∶1示出了两个结合的酶，条带1∶1示出了一个结合的酶。DNA条带对应单独的DNA。图6示出了当解旋酶T4 Dd-E94C/C109A/C136A/A360C和TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C控制DNA构建体(参见上文电流轨迹)移位穿过MspA纳米孔时的示例电流轨迹。x轴对应时间(秒)以及y轴对应电流(pA)。所述轨迹示出了在所述两种解旋酶控制下单个DNA链移动穿过纳米孔，标记的区域1和2对应DNA构建体的区域1和2的移位。所述轨迹示出了在解旋酶T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C和TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C二者控制下构建体Y移位穿过纳米孔时观察到的电流轨迹。箭头标记的3示出了当发夹衔体中的间隔器移位穿过纳米孔时电流的尖峰。所述发夹衔体和Y衔体间隔器在电流轨迹上方的DNA构建体的图片中以x示出。图7示出了Agilent生物分析仪轨迹，表明酶预结合到MuA Y衔体。图8示出了Agilent生物分析仪轨迹，表明当酶预结合到MuA Y衔体时，没有见到对靶DNA的副作用。图9示出了当由解旋酶控制DNA移动穿过使用由MuA标签技术(tagmentation)产生的DNA制备的纳米孔时的示例电流轨迹。图10示出了具有预结合的E1(A片段)及E2(END片段)的A片段(见分图A)和END片段(见分图B)的装载部分。这两个装载部分接合到实施例6中的基因组DNA。所述A片段具有标记为1的39个SpC3间隔器的区本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法，包括：(a)提供结合到一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白；以及(b)将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.22 GB PCT/GB2014/050175;2014.04.04 GB 14061.一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法，包括：(a)提供结合到一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白；以及(b)将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在步骤(a)之前将所述多核苷酸结合蛋白结合到所述一个或多个装载部分。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白衍生自一个或多个多核苷酸处理酶。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸处理酶是一个或多个聚合酶、核酸外切酶、解旋酶、拓扑异构酶，或其组合。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一个或多个解旋酶为a)Hel308解旋酶、RecD解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶；(b)衍生自(a)中所述任何解旋酶的解旋酶；或(c)(a)和/或(b)中所述解旋酶的任意组合。6.根据权利要求5所述的方法，其中对所述一个或多个解旋酶进行修饰，以减小所述多核苷酸结合域中开口的大小，所述多核苷酸在至少一个构象下穿过所述开口从解旋酶上解绑。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法涉及连接两个或更多个多核苷酸结合蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述两个或更多个多核苷酸结合蛋白除非由所述一个或多个装载部分连接，否则彼此不连接。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个多核苷酸结合蛋白彼此不同。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白在步骤(b)结束时保持结合到所述一个或多个装载部分。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个装载部分是合成的。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个装载部分包含装载多核苷酸。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个装载部分包含所述一个或多个多核苷酸结合蛋白结合的单链多核苷酸。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白衍生自解旋酶，所述解旋酶停滞在所述一个或多个装载多核苷酸上的一个或多个间隔器处。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是双链多核苷酸。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个装载部分中的至少一个是Y衔体。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述Y衔体包含优先螺入所述孔中的前导序列。18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述一个或多个装载部分中的至少一个是桥连部分。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述桥连部分是发夹环。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述发夹环的茎干为少于200个核苷酸对的长度。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个装载部分包含一个或多个能够耦合到膜的锚。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个装载部分包含装载多核苷酸，且步骤(b)包含使用连接酶将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法进一步包括(c)从方法条件中去除所述连接酶。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中步骤(b)是在ATP不存在或使用γ-S-ATP(ATPγS)代替ATP的情况下进行的。25.一种表征靶多核苷酸的方法，包括：(a)实施前述权利要求中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：安迪·赫伦，克莱夫·布朗，瑞贝卡·鲍恩，詹姆斯·怀特，丹尼尔·约翰·特纳，约瑟夫·哈格里夫·劳埃德，克里斯多夫·彼得·约德，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB